Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер
Молекулярлы тор хроматографиясы
жүктеу/скачать 5,04 Mb. Pdf көрінісі
|
| 2.4. Молекулярлы тор хроматографиясы
Хроматографияның бұл əдісі 1959 жылы пайда болып, қазіргі заманғы биохимияда Д. Порат жəне П. Флодин кезінде енген болатын. Осы кезеңге дейін хроматографияның бұл түріне біртекті ұғым беретін термин болмаған. Ол бізге «гель-фильтрация», «гель хроматография» «енгіш хроматография» атауларымен белгілі. Осы атауларды қарап, «молекулярлы тор хроматография» деп атаған дұрыс, бірақ «гель енгіш хроматография» термині де осы үдерісті көрсетеді. Бұл əдіс өте жаңа болғанмен, биохимиктер мойындап, қолданысқа ие болып отыр. Қазіргі кезде көптеген зерттеулер бұл əдіссіз жүзеге аспайды. Молекулярлы-тор хроматографияға үш түрдің тасымалдаушыларын: ксерогельдер, аэрогельдер жəне ксерогельдер гибридтері аэрогельдер- мен қолданады. Ксерогельдер – үш өлшемді полимер тізбектерінен гель бөлшектерін түзетін органикалық полимерлер. Яғни гель полимер тізбектерінің гидратацияланған үш өлшемді торынан тұрады. Құрамында еріткіші бар. Аэрогельдер сұйық фаза болмағандықтан, гельдерге жатпай- ды. Аэрогель мен ксерогель гибридтері басқа да гель типтерімен ұқсас келеді. Бұл гельдердің полимерлері матриксі сольватацияға аз қатысатын, жартылай қатты құрылымдардан құралған. Ксеро- аэрогельдердің гибриді – хроматография үшін макроретикулярлы полистерді тасымалдаушы. Гельдер тобындағы құрылымдық ерекшелік бірінші кезекте олардың еріткішке қатынасында ксерогельдер қатты үрленген, солватирлен- 78 ген, компрессияға аз тұрақсыз гель береді. Аэрогельдер жоғарыдағы қасиеттерді иеленбесе де, өте ірі саңылаулары бар жəне үлкен арнау- лы баған адсорбцияға ие. Сондықтан оларды əртүрлі молекулалық салмағы бар заттарды фракциялауға қолданады. Барлық типтегі гельдер саңылау құрылымды болғандықтан, əр көлемдегі молекулалар, əртүрлі мөлшердегі гель саңылаулары гель бөліктерінің ішкі бөлімінде диффузия үдерісі жүреді, ол көлемі жағынан тек гель бөлшектерін қоршап тұрған ерітінді көлемімен қозғала алады. Нəтижесінде, кіші молекулалар үлкендерге қарағанда ұзақ жолдан өтеді, бағаналарда ұсталып қалады. Гель енгіш хроматографияның маңызды қасиеті бағананың барлық ерітіндісінің көлемін жəне ерітіндідегі гель арасынан бөлінген молекулалардың араласуын көрсететін тарату коэффициенті бо- лып табылады. Үлкен мөлшерде, еркін көлемде енетін молекулалар геларалық фазалардың көлемінің коэффициенті нөлге тең болады, ал гельдің барлық саңылауларына енетін ұсақ молекулалар коэффициенті 1-ге тең. Мұндай сандық көрсеткішті коэффициенттер молекулалық салмағымен ерекшеленетін заттарды бөлуде, мысалы, белоктардың ірі молекулаларын тұзсыздандыруда байқалады. Мұнда молекуланы бөлiкшеде да орналастыру коэффициенті 0-ден 1 м аралықта жүреді. Бұл гель енгіш хроматографияны белоктардың молекулалық салмағын анықтауға мүмкіндік береді. Сонымен қатар тарату коэффициентінің жақын мəндері бөлінетін зат көлеміне шектеумен орнықтырады, ол бағана көлемінен 3%-дан артық болмауы керек. 2.2-кестеде гель енгіш хроматографияға көп қолданатын сорбент- тердің сипаттамасы көрсетілген. 2.2-кесте Гель енгіш хроматографияға қолданатын сорбенттердің сипаттамасы [М. Гильманов жəне т.б., 1981] Сорбенттердің атауы жəне түрі Фирмасы жəне өндіруші мемлекет Молекулалық массаларға диапазондық тарату Ескерту 1 2 3 4 Сефадекс Г-10 Фармация, Швеция 0-700 Сусыз ерітіндідегі хроматография Сефадекс Г-15 Фармация, Швеция 0-1500 Сефадекс Г-25 Фармация, Швеция 1000-5000 79 2.2-кестенің жалғасы 1 2 3 4 Сефадекс Г-50 Фармация, Швеция 1500-30000 Сусыз ерітіндідегі хроматография Сефадекс Г-75 Фармация, Швеция 3000-70000 Сефадекс Г-100 Фармация, Швеция 4000-150000 Сефадекс Г-150 Фармация, Швеция 5000-400000 Сефадекс Г-200 Фармация, Швеция 5000-800000 Сефадекс LH-20 Фармация, Швеция -5000 Биогель Р-2 Био-Рад, АҚШ 200-2500 Биогель Р-4 Био-Рад, АҚШ 500-4000 Биогель Р-6 Био-Рад, АҚШ 1000-5000 Биогель Р-10 Био-Рад, АҚШ 5000-17000 Биогель Р-30 Био-Рад, АҚШ 20000-50000 Биогель Р-60 Био-Рад, АҚШ 30000-70000 Биогель Р-100 Био-Рад, АҚШ 40000-100000 Биогель Р-150 Био-Рад, АҚШ - 50000-150000 Биогель Р-200 Био-Рад, АҚШ 80000-300000 Биогель Р-300 Био-Рад, АҚШ - 100000-400000 Ультрагель АсА 22 ЛКВ, Швеция 100000-1200000 Ультрагель АсА 34 ЛКВ, Швеция 20000-350000 Ультрагель АсА 44 ЛКВ, Швеция 10000-130000 Ультрагель АсА 54 ЛКВ, Швеция 5000-70000 Сефакрил С-200, суперфайн Фармация, Швеция 5000-250000 Сефакрил С-300, суперфайн Фармация, Швеция 10000-1500000 Сефароза 2В Фармация, Швеция 70000- 40000000 СI типті де көлденең тігілген түрлері де шығарылады Сефароза 4В Фармация, Швеция 60000-20000000 Сефароза 6В Фармация, Швеция 10000-4000000 Швециядағы «Фармация» фирмасы шығаратын «Сефадекс» гелі түрі кеңінен қолданылуда. Бұл атау ағылшынның «Separation Pharmacia dextram» деген сөзінің бастапқы түбірінен құралған. 80 Сефадекстерді табиғи декстраннан сусыз ортада эпихлоргидрин- мен қажетті мөлшерде тесікті кезеңге жеткеннен кейін алады. Мықты тігілген Г-25 типті гельдер қатты сығылуға төзімді жəне қаттылығымен ерекшеленеді, ал Г-150, Г-200 типтегі гельдер борпылдақ құрылымды жəне қысыммен əсер етуде əлсіз болып табылады. Гель енгіш хроматографияға түтік таңдауда зерттеушінің алдында тұрған міндетіне байланысты. Тазартылмаған фракцияға түтік диаметрінің гель биіктігінің қаты- насына тең байланысы жеткілікті: 1:10, ал белоктардың молекулярлық салмағын анықтауға 1:20-ға қатынасы немесе 1:30-ға қатынасы тең болуы керек, өте жіңішке бағанадан бөлу сапасы бұзылады. Дайын, салқындатқыш сулы жабындысы бар түтік алған тиімді. Егер ол болмаған жағдайда қолдан жасалғандарды қолдануға болады, осы кез- де бос кеңістіктің аз болуын қадағалау керек. Түтікті шыны бюреткадан дайындап, төменгі бөлігін шыны мақтамен тығындау ұсынылады. Əдетте, тəжірибеде шыны түтікте резеңке тығынның түтіктің жартысына дейін ғана еніп тұратынын таңдап аламыз. Беткі жағын егегіш қағазбен тегістейміз, тығынның дəл ортасына диаметрі 1,5-2,5 мм екпе инесімен немесе пластмасса штуцермен орналастырамыз. Орналастыруда бір шеті шұңғыма тəрізді беткі бөлігін, ал 2-бөлігі тығынның кең бөлігіне еніп тұруын қадағалау керек. Мүмкіндігінше, пластмасс штуцерде қосымша əртүрлі пласти- калы түтік немесе жалғайтын бұрандалы кесінді болғаны дұрыс. Штуцерлі төменгі тығынды дайындап болған соң, оның жіңішке жерін капрон матамен тартып, тығынды матамен бірге түтікті төменгі бөлігіне орналастыру керек. Тығынды түтікке тығыз кіргеннен кейін, одан шығып тұрған артық матаны қиып тастап (алмаспен), түтіктің геометриялылығын тексереміз. Түтікті толтыруға сефадекс жабындысын алып, суға немесе буфер ерітіндісіне құяды, толық үрленген соң түтікті толтыруға қолданады. Ол үшін одан жоғарғы тығынды алып, ¼-ін сумен толтырады, жай- лап шайқалған гель суспензиясын құяды, сол кезде төменгі штуцермен артық суды шығарады. Түтікті бөлудің сапасын бұзатын біртексіздік болмауы үшін, үздіксіз толтырып отырады. Дайын болған түтікті 2-5 мл 0,2%-дық «терең декстран 2000» ерітіндісінен өткізе отырып, тексереді. Түтік нашар толтырылған, қабырғасы бүлінген болса, бояу- шы аймағы қатты. 81 Бұл жағдайда түтік қайтадан толтырылады. Егер дұрыс дайын- далған болса, буфер ерітіндісімен шаюға қояды. Содан соң белок ерітіндісін енгізуге жоғарғы тығынды құбыршегімен бірге шешіп, гельдердің жоғарғы бөлігіне кебуге мүмкіндік беріп, дəл ортасына белок ерітіндісін құяды. Белок гельге енгеннен кейін (қайтадан гель ортасына), тамшылатқышпен белок көлемінен 2-3 есе асатын буфер ерітіндісін құяды. Бұл ерітінді гельге енген соң, элюция жүйесін қосуға болады. Элюат фракциясын түтіктен фракцияның автоматты коллекторы көмегімен, ал тез тұзсыздануды қолмен жинауға болады. Сефадекспен жұмыс істеу барысында ол буфер ерітіндісінің төменгі ионды күшінен (0,05 M) арнайы емес белоктардың адсорбциясына ие болады. Бұл құбылысты болдырмау үшін 0,1 M KCl буфер ерітіндісін қолданады. Жұмыс барысында түтік ластанады, оны тазалауға түтік арқылы 0,1 М NaОН немесе ионды емес детергент жібереді де, тезірек шайып тастайды. Сефарозды тазалауда сілті қолдануға болмайды. Түтікті консервациялауда көбінесе 0,02% натрий азидін қолданады. Гельді кептірілген күйде сақтауға болады. Ол үшін сефадексті этил спиртінің үлкен концентрациясымен құрғатамыз. 96° спиртпен шайылған сефадексті диэтилді эфирмен кептіреді. Зерттеу жүргізуде əр тұрпаттағы гелі бар бірнеше түтік болғаны дұрыс. Бұл тұзсыздандыруды тездетуге, яғни белоктары бар буфер ерітіндісін тезірек ауыстырып, белоктарды фракциялауға, белоктардың молекулалық салмағын анықтауға мүмкіндік береді. Алғашқы ІІ операцияны жүргізуге Г-25 немесе Г-50 типті сефадексі бар түтікті, ал соңғы ІІ операцияны жүргізуге Г-150 жəне Г-200 типті сефадакстен ерекшеленетін, ультрагельдер мен сефакпильдерді алған дұрыс. Сефароза жəне оған ұқсас – агароза жəне био-гель А үлкен салмағымен ерекшеленеді, молекулаларды бөлуге өте қолайлы. Кейбір жағдайда молекулалық салмағы бойынша белоктарды бөлуде жұқа гель енгіш хроматография əдісін қолдануға болады. Көбіне белоктық үлгісі аса үлкен емес болғанда, жұқа қабатты гель енгіш хроматография бір уақытта бірнеше үлгіні бөлуге мүмкіндік береді. Сонымен қатар сараптаманың өзі өте қарапайым орындалады жəне сорбентті көп жұмсауды қажет етпейді. Жұқа қабатты гель енгіш хроматографияға Г-150 жəне Г-200 сефадекстері, өте жұқа «суперфайн» маркалары қолданылады. Гель қолданылар алдында 3-5 тəулік ісінуі керек. 82 Гельді 20х40 см таспаға жағар алдында вакуумда газсыздандыру жүргізіп, одан артық сұйықты төгіп тастау керек. Сосын қоймалжың гель суспензиясын əбден жуылған шыны таспаға жағып, арнайы құралмен (шыны таяқша) тегістейді. Гелі бар дайын болған таспаны камераға салып, 15° иілу беріп, таспа жиегіне сүзгi қағазынан көпірше жасайды, екінші жағына 0,01 М КСl бар 0,05 М трис-НСl, буфер рН 7,7 салады. Жұқа қабатта гель хроматографияны сақтау камерасы табақшадағы гель кеуіп кетпеуі үшін тығыз жабылған болуға тиіс. Жұмыс алдын- да таспаны толық буфер ерітіндісімен жуып, ерітіндіге көпіршеден бір түн бойы тамшылауға мүмкіндік беру керек. Содан соң гель старт- ты буфер жоғарғы бөлігіне жабын шынысының көмегімен, Б.Радола бойынша немесе микротамшылатқышпен белокты енгізеді. Таспаның жиегіне орналастырылған үлгілерге 0,1-0,2% терең декстран 2000 ерітіндісін енгізеді (белок ауданының қозғалысын бақылау үшін). Белок ауданы 17-20 см өткеннен кейін, гель таспасын камерадан алып, репликаны шешеді. Бөліп алынған белоктар қалың хромато- графия қағазына сіңіріледі. Репликаны босатқаннан кейін 105°С-та кептіріп, белоктарды 1% сулемасы бар 2% сірке қышқылында, 0,1% бромфенол көк ерітіндісінде 40 минут аралығында бояйды. Артық бо- яуды 2% сірке қышқылымен, содан соң дистильденген сумен жуып, кептіреді. «Кумаси бриллианты көгілдір R-250» бояуымен бояу өте сезімтал бояуды береді. Кейбір жағдайда 0,25% бояу ерітіндісін ме- танол жəне мұзды сірке қышқылы қосындысында (90:10) алып, 30 минуттан соң метанол-мұзды сірке қышқылын сумен араласқан ерітіндімен (50:10:50) жуып тастайды. Ферментте түзілген репликалар кептірілмейді. жүктеу/скачать 5,04 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|