Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер
M ацетат калийдің көмегімен жиынтық
жүктеу/скачать 5,04 Mb. Pdf көрінісі
|
Kenzhebayeva (1) (1) (1)
| 3.3. 5M ацетат калийдің көмегімен жиынтық
ДНҚ-ны бөліп алу əдісі Жалпы мағлұматтар. Ұсынылып отырған бұл əдіс белгілі бір мөлшерден (100-200 мкг) жиынтық ДНҚ-ны тез бөліп алуға мүмкіндік береді; осы кезде жоғары сапалы ДНҚ мөлшері көрінеді. Берілген əдіс өсімдіктің əртүрлі тұқымдастарынан ДНҚ бөлуде қолданылады (қарақат, Метликовые, орам жапырақ, майлы, бұршағы жəне т.б.). Бұл əдісті қолданғанда ~1…7 мкг ДНҚ бөлінеді. Алынған ДНҚ алу- ан түрлері молекуларлы маркерлерге жəне микросателитті талдауға жарамды, бөлек гендер мен локустар талдау кезінде ПЦР анализін жүргізуде. Мұндай əдіспен бөлінген ДНҚ рестриктазалардың көбісімен гидролизденеді де, алуан түрлері молекуларлы таңбалағыштарға тал- дауларын, Саузерн блоттингті жүргізуге жарамды. Жұмыс жасау барысы: Түтiккі 1 см 3 жапырақты өсімдік материа- лын енгізеді (алдын ала арқаулардан тазалайды). 400 мкл лизирлеуші буферді қосады: 250 мМ Трис (рН 8,0), 250 мМ NaCl, 50 мМ ЭДТА- ны, 1% SDS-Na-ті қосады да келсаппен келіге гомогенді күйге дейін салып езеді. Су немесе ауа моншасында 20 мин бойы 65°С темпера- турада толық еруі үшін аздап араластырып инкубациялайды. Алдын 114 ала салқындатылған 5 M калий ацетатының (pH 5,2) 200 мкл қосады. Біраз араластырып, мұзды моншада 20 мин бойы инкубациялайды. Клеткалық дебристі 15 мин бойы 12000 айналымда (g) центрифугалап, тұнбаға түсіреді. Тұнба бетіндегі сұйықты жаңа түтiкке іріктеп алады. Фенолдың хлороформмен қоспасының тең көлемін алып қосады да, галогенді эмульсия алғанға дейін араластырады. Су жəне органикалық фазаларды 5 мин бойы 12000 айналымда (g) центрифугалау арқылы ажыратады. Интерфазаны араластырмай, су фазасын таза пробиркаға іріктеп алады. Тазалауды қайтадан жүргізеді. 5 мин бойы 12000 ай- налымда (g) центрифугалайды. Қайтадан ақырындап су фазасын таза пробиркаға жинап алады. 96% салқын этанолдың екі көлемін қосады да, тұнба түскенге дейін араластырады. Тұнба толығымен түсуі үшін түтiкті 20°С температурада 30 мин бойы (немесе түнге қалдырады) мұздатады. Нуклеин қышқылдарын 15 мин бойы 12000 айналымда (g) центрифугалап тұнбаға түсіреді. Тұнбаны 200 мкл 70% этанолмен шая- ды, 2-3 рет оны қайталайды. Тұнба түбінен ажырайтын болса, тағы да центрифугалайды. Тұнбаны кептіреді де, 20-50 мкл дистильденген суда ерітеді. ДНҚ ерітіндісін 4°С температурада сақтайды. Алынған ДНҚ-ны келесі рестрикциялық талдауларды жүргізу үшін немесе полимеразалық тізбектік реакцияға негізделген əдістер үшін кестелiк ретінде пайдаланады. жүктеу/скачать 5,04 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|