Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер
Құрамында көп мөлшерде фенолы бар өсімдіктердің
жүктеу/скачать 5,04 Mb. Pdf көрінісі
|
| 3.5. Құрамында көп мөлшерде фенолы бар өсімдіктердің
құрамынан ДНҚ бөліп алудың жиынтық əдісі Кейбір екіншілік метаболиттердің жəне барлық фенол өндіру- шілердің қасиеті лизистен кейін ДНҚ-мен байланысып, нуклеин қышқылдарының жылдам деградациясына септігін тигізеді. ДНҚ-ны құрамында полифенолы бар өсімдіктерден бөліп алудың қарапайым əдістерін қолдансақ, ДНҚ аз мөлшерде жəне құрамы онша таза жəне сапалы болмайды. Құрамында полифенолы көп өсімдіктерге жемісті сүйекті ағаштар жатады. Оларға алма, алмұрт, қара өрік, алхоры, шие, шабдалы, өрік, құрма, алқоры, жүзім жатады жəне жалаңаштұқымдылар: шырша, самырсын, арша, қарағай жатады. Бұл əдісті қолданудың негізі поливинилпиролидонды (PVP) агент ретінде қолдану нəтижесінде полифенолдың əсерін ингибацияланады. Осы ингибациялаушы қасиетіне байланысты 50 мкг өсімдік материалынан 5-12 мкг таза ДНҚ экстракциялауға мүмкіндік туады. Осы жағдайда алынған ДНҚ тазалығы өте жоғары болады. Жұмыс жасау барысы: 2-3 см 2 болатын жапырақ материалын алып, оның ірі талшықтарын алдын ала тазалап қояды. Оны ұсақтап турап, түтiкке салады. Ұсақталған материалға 10 мл 0,5%-дық меркаптоэта- 117 нолды қосады да, гомогенизациялайды. Езіндіге 300 мкл лизистеуші буфер қосады. Ол буфердің құрамына төмендегі реактивтер кіреді. 200 мМ Трис РН-8,0 250 мМ NaCl 2,5 мМ ЭДТА 0,5% SDS Осы буфердің көмегімен бір сағат бөлме температурасында ақырын шайқап отырып инкубациялайды. Одан кейін алдын ала жаңадан да- йындалып қойған PVP-ді қосады да, оны 6% концентрацияға жеткізеді. Үстіне 0,5 мл мөлшердегі 7,5% аммоний ацетатын қосады. Суық мон- шада 30 минут инкубациялап, одан кейін 120000 айналымда (g) 10 мин 4°C температурада центрифугалайды. Алынған сұйық ерітіндіні басқа пробиркаға ауыстырады. Дəл сол сұйықтың мөлшеріне байланысты етіп, сұйылтылған изопропанолды қосады да, 30-45 мин ДНҚ-ны пре- типитациясы үшін қалдырады. Одан кейін ДНҚ-лы ерітіндіні қайтадан 12000 айналымда (g) 15 мин центрифугалайды да, беттік сұйықтықты төгіп, ДНҚ шөгіндісін кептіріп, шөгіндіні 500 мкл суда немесе ТЕ буферінде ресуспензиялайды. ТЕ буфердің құрамына төмендегі реак- тивтер: 10 мМ Трис РН -8,0, 1 мМ ЭДТА кіреді. Кейін оның үстіне 1 мкл РНҚ-аза ферментін қосады. Бөлме тем- пературасында 30 мин инкубациялайды. Инкубациялап болған соң, хлороформ мен изоамилді спиртті араластырып қосып, гомогенді эмульсия болғанша асықпай араластырады. Оны да 12000 айналым- да (g) 5 мин центрифугалайды. Одан кейін сулы фазасын алып, басқа түтiкке ауыстырады. Интерфазаны жою үшін процедураны екі-үш рет қайталайды. Кейін сулы фазаға осы фазаның мөлшеріне сай келетін изопропанол қосады да он бес минут өткеннен кейін 120000 айна- лымда (g) 10 мин центрифугалайды. Алынған шөгіндіні 300 мкл 70% этанолда жуады да, щөгіндіні кептіріп, 20-30 мкл дистилденген суда ерітеді. ДНҚ ерітіндісін 4°C температурада сақтайды. Осы əдіспен бөлініп алынған ДНҚ-ны рестрикциялық талдау жасау үшін жəне ПЦР талдау үшін қолданады. жүктеу/скачать 5,04 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|