Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер
Став детергентін қолдану арқылы. Сандық ДНҚ бөлу əдісі
жүктеу/скачать 5,04 Mb. Pdf көрінісі
|
Kenzhebayeva (1) (1) (1)
| 3.4. Став детергентін қолдану арқылы. Сандық ДНҚ бөлу əдісі
Бұл əдісті əртүрлі тұқымдастағы (бір үйлі екі үйлі сияқты) өсімдіктерден ДНҚ бөліп алуда жиі қолданады. Бұл əдістеме жалаңаш тұқымдылардан, мүктерден жəне папоротниктерден ДНҚ экстракция- сына да қолданылады. Айтарлықтай өзгерістерсіз бұл əдісті лиофили- зирленген жəне гербарийлы материалдардан ДНҚ- дəрi-дəрмек алуда қолданады. Нуклеин қышқылдарын бөлу əдісінде став детергентін қолдану 0,7 М NаCl концентрация қатысында ДНҚ- жəне РНҚ-ны СТАВ-тан тұрақты, бірақ еритін құрылымдар түзуге негізделген, яғни тұз кон- центрациясын 0,4 М құрылымға дейін төмендеткенде, СТАВ-ДНК жəне СТАВ-РНК тұнбаға түседі, сол уақытта белоктар бен полисаха- ридттер ерітіндіде қалады. Кейін тұз концентрациясын қайта көтеріп, СТАВ-нуклеин қышқылының тұнбасы еріп, этанолды немесе изопро- панол қосқанда құрылым бұзылып, тек нуклеин қышқылы тұнбада қалады. 115 CТАВ-ДНҚ-ның СТАВ-РНҚ-ға қарағанда тұнбаға түсу констан- ты айтарлықтай жоғары болғандықтан, СТАВ-ДНҚ комплексі преци- питирлеп, ал сол уақытта СТАВ-РНҚ ерітіндіде қалатындай жағдай таңдап алуға болады. Сөйтіп, бөлінген ДНҚ-ны РНҚ-дан бөліп алуға болады. Сөйте отырып, əр өсімдікте СТАВ-құрылымының тұнбасына түсу констан- ты бірнеше рет өзгеретінін байқау керек. Мысалы, ДНК-ны астық тұқымдастардың өсінділерінен бөлуде СТАВ-нуклеин қышқыл комплекстері натрий хлоридттің 0,33 М концентрациясында тұнбаға түсе бастайды. Бұл əдісті қолдану барысында 1г өсімдік ұлпасынан 100 мкг ДНҚ бөліне бастайды. Осы əдіс бойынша бөлінген ДНҚ жоғарғы моле- куларлы (орташа өлшемі 25 мыңнан астам жұп нуклеотидттер) бо- лады; осының арқасында оны геномды кітапхана алуға қолдануға болады. Осы əдіспен бөлінген ДНК көбіне эндонуклеаза əсеріне рестрицирленеді жəне алуан түрлері молекуларлы маркерлерге (RFLP- жəне AFLP-талдауларға) сараптамасын саузерн бойынша блоттингті, сонымен қатар əдістермен молекулалық талдау (полимеразды байлам реакциясына негізделген) жүргізуге жарамды. Жұмыс жасау барысы: 1 г өсімдік ұлпасын (мүмкіндігінше өсінді немесе жас жапырақ) сұйық азотпен алдын ала салқындатылған келіде езеді. Салқындатылған түтiкке ауыстырып, құрамында: 100 мМ Трис (pH 8,0), 1,4 М NaCl, 2 мМ ЭДТА 2% СТАВ салмағы бойынша, 4 мМ бета- меркаптоэтанол бар, 7,5 мл ыстық (~ 65°С) буферді экстракция 2xЕВ үшін қосады. Ақырындап, клетканың толық лизисі үшін бірнеше рет араластыра отырып, 65°С 1 сағат инкубациялайды. Түтiкті бөлме температурасына дейін салқындатып, тең көлемде хлороформның изомилді спиртпен қосындысын қосады. Толқынды қозғалыспен 15 мин гомогенді эмульсия түзілгенше араластырады. 15 мин 5000 ай- налымда (g) центрифугалайды. Беткі су фазасын жаңа пробиркаға бөліп алып, 1/10 бөлігінде 10% СТАВ ерітіндісін (созылмалы детергент ерітіндісінің керек мөлшерін оңай алу үшін оны 65°C қыздыру керек) қосады. Тең көлемде хлороформның изоамилді спиртпен қосындысын қосып, гомогенді эмульсия түзілгенше 15 мин жайлап араластырады, 5000 айналымда (g) 15 мин бойы центрифугалайды. Тағы да су фазасын бөліп алып,1/30 көлемінде 10% СТАВ қосып, хлороформның изоамилді спиртпен қосындысымен экстракцияны қайталайды. 116 СТАВ-нуклеин қышқылын тұндыруға құрамына 5 мМ Трис (рН 8,0), 10 мМ ЭДТА, 1%-ті СТАВ кіретін РВ-буферін тең көлемде қосады. Араластырып, 15 мин бөлме температурасында инкубациялайды. Егер тұнба түзілмесе, онда 30 мин 65°С инкубациялайды. 12000 ай- налымда (g) 30 мин бойы центрифугалайды. Тұнба бетіндегі сұйықты толық құйып алып, тұнбаны құрамына, 1 М NaCl, 10 мМ Трис (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА кіретін, ыстықтай (~65°С) 1-2 мл ТЕ-буферінде ерітеді. Бұдан тұнба нашар еруі мүмкін. Бұл жағдайда 65°С-та 30 мин инкубациялайды. Екі көлемде салқындатылған этанол қосып араластырады. Сосын 20°С-да 1-3 сағат бойы инкубациялайды (бұл сатыда преципитирлеуші ДНҚ-ның жүктерын көруге болады). 10000 айналымда (g) 30 мин центрифуга- лайды. Тұнба бетіндегі сұйықты төгіп тастап, тұнбаны салқын 70% этанолмен бірнеше рет қайталап шаяды. Тұнбаны кептіріп, дистильденген суда немесе ТЕ-буферде (10 мМ Трис, 1мМ ЭДТА) ерітеді. ДНҚ-ны 4°С-та сақтайды. Ұзақ уақыт сақтау талап етілетін жағдайда -20°С да сақтайды. жүктеу/скачать 5,04 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|