Микробиология
Полимеразалық тізбекті реакцияны (ПТР)
жүктеу/скачать 5,08 Mb. Pdf көрінісі
|
BulashevAK BMB.pdf
- Бұл бет үшін навигация:
- 21-сурет. Полимеразалық тізбекті реакция кезеңдері (Шумилов К.В. және басқалар бойынша, 1996).
|
Полимеразалық тізбекті реакцияны (ПТР) 1983 жылы Кэри Мюллис ашқан. ПТР кейінгі кезде инфекциялық аурулардың балауда қолданылатын нақты және сезімтал әдістердің бірі болып саналуда. ПТР бактерия немесе вирустардың генін in vitro жағдайында термостабильді ДНҚ-полимераза ферментінің кӛмегімен бірнеше миллион есе кӛбейтіп алып (амплификация), электрофорезбен анықтауға бағытталған. Бҧл реакция ДНҚ репликациясы деп те аталады. Табиғи жағдайда ДНҚ репликациясы бірнеше сатыдан тҧрады: 1) ДНҚ денатурациясы (ДНҚ қос жіпшесінің тарқатылып, ажырауы); 2) ДНҚ-ның синтезделуіне қажетті қысқа екі тізбекті ДНҚ учаскесінің қалыптасуы; 3) ДНҚ-ның жаңа тізбегінің синтезделуі (қос жіпшенің комплементарлы қҧрастырылуы). Бҧл реакцияда микроорганизмдер генінің учаскесінің қҧрылымын қайталауға қатынасатын, жасанды жолмен синтезделген олигонуклеотид пен Tag- полимераза ферменті қолданылады. Tag- полимераза ферментінің кӛмегімен ДНҚ-ның телімді фрагменті қалыптасады. Жаңадан қалыптасқан ДНҚ фрагменттері нуклеин қышқылдарының жаңа тізбектерін синтездеуге арналған матрица ретінде амплификацияның келесі циклдерінде пайдаланылады. 53 Полимеразалық тізбекті реакцияның қойылым жолы ҥш кезеңнен тҧрады (21-сурет): биологиялық материалдардан ДНҚ бӛліп алу; полимеразалық тізбекті реакцияны қою; электрофорез немесе гибридизациялы-ферменттік детекция (амплификация ӛнімдерінің детекциясы). 21-сурет. Полимеразалық тізбекті реакция кезеңдері (Шумилов К.В. және басқалар бойынша, 1996). Жҧмыстың әрбір кезеңі міндетті тҥрде жеке бӛлмелерде, санитарлық-гигиеналық талаптар мен санитарлық-эпидемиологиялық ережелерді сақтай отыра, ПТР-ға арналған жиынтық кӛмегімен жҥргізілуі тиіс. ПТР-ға арналған жиынтық қҧрамы ҥш комплекттен тҧрады: №1 комплект – биологиялық материалдардан ДНҚ бӛліп алуға, №2 комплект – ДНҚ амплификациясына, ал №3 комплект – ДНҚ детекциялауға арналған. ДНҚ бөліп алуға қажетті комплект қҧрамына лизиске ҧшыратушы ерітінділер мен сорбент кіреді. Ҥлгілерді ӛңдеу жҧмыстары кӛлемі 1,5 54 мл болатын микроцентрифуга тҥтіктерінде 90-120 минут бойы жҥргізіледі. Центрифугаланған ҥлгі тҧнбасын лизиске ҧшыратушы ерітіндімен ӛңдеп, депротеинизациялағаннан кейін сорбент кӛмегімен тазартады. Полимеразалық тізбекті реакцияны қою ҥшін қолданылатын комплект қҧрамына ПТР-буфер, дезоксинуклеозидҥшфосфаттар қоспасы, телімді қос олигонуклеотидті праймерлер, Tag- полимераза, минералды май кіреді. Зерттеуге алынған ҥлгінің белгілі бір мӛлшерін арнайы «Eppendorf» тҥтікшелеріне енгізгеннен кейін ҥстінен амплификациялаушы қоспаларды, Tag- полимераза ферментін және бір тамшы минералды майды қосады да, автоматтандырылған термостатта амплификация процесі 2-3 сағат аралығында жҥргізіледі. Зерттеуге алынған ҥлгілермен бірге бақылау ҥлгілері де қатар қойылады. Нәтижелерді тіркеуге арналған комплект қҧрамына электрофорез буферлерінің қоспалары мен агароза гелі жатады. Жҧмыстың бҧл кезеңі амплификацияланған телімді ДНҚ фрагменттерін қҧрамында этидий бромиді бар 1%-ды агароза геліндегі электрофорез кӛмегімен іске асырылады. Электрофореграмма нәтижесі ультракҥлгін сәуле шығаратын трансиллюминаторда оң нәтиже кӛрсеткен амплификация ӛнімдері (ДНҚ) мен бақылауға алынған ДНҚ препаратында қызғылт- сары тҥсті болып жарқырап кӛрінеді. жүктеу/скачать 5,08 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|