В. В. Зверева, М. Н. Бойченко
жүктеу/скачать 4,99 Mb. Pdf көрінісі
|
микробиология т-1, Зверев
| суспензионных культур
клеток размножаются во всем объеме питательной среды при постоянном ее перемешивании с помощью магнитной мешалки или вращающегося барабана. Метод применяют для получения большого количества клеток, например, при промышленном получении вирусных вакцин. Органные культуры применяются ограниченно. Они представляют собой цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие при культивировании исходную структуру. По свойствам жизнеспособных генераций культуры клеток подразделяют на первичные, или первично-трипсинизированные, перевиваемые, или стабильные и полуперививаемые. Первичные культуры клеток размножаются только в первых генерациях, т.е. выдерживают не более 5-10 пассажей после выделения из тканей. Их получают при обработке кусочков тканей (эмбриональных, опухолевых или нормальных) протеолитическими ферментами, которые разрушают межклеточные связи в тканях и органах с образованием изолированных клеток. Перевиваемые, или стабильные, культуры клеток способны размножаться в лабораторных условиях неопределенно длительный срок (десятки лет), т.е. выдерживают многочисленные пассажи. Их получают преимущественно из опухолевых или эмбриональных тканей, обладающих большой потенцией роста. Перевиваемые культуры клеток имеют преимущества перед первичными культурами: продолжительность их культивирования, высокая скорость размножения опухолевых и эмбриональных клеток, меньшая трудоемкость, способность культур сохранять свои свойства в замороженном состоянии в течение многих лет, возможность использования международных линий культур во многих лабораториях мира. Однако злокачественный характер клеток и соматические мутации, претерпеваемые нормальными клетками в процессе многочисленных генераций, ограничивают использование этого вида культур, в частности их нельзя применять в производстве вирусных вакцин. Полуперививаемые культуры клеток имеют ограниченную продолжительность жизни и выдерживают 40-50 пассажей. Их обычно получают из диплоидных клеток эмбриона человека. В процессе пассажей эти культуры сохраняют диплоидный набор хромосом, характерный для соматических клеток исходной ткани, и не претерпевают злокачественную трансформацию. Поэтому полуперививаемые культуры клеток могут быть использованы как в диагностике, так и в производстве вакцин. О репродукции вирусов в культуре клеток, зараженных вируссодержащим материалом, можно судить на основании следующих феноменов: цитопатогенного действия (ЦПД) вирусов, или цитопатического эффекта (ЦПЭ), образования внутриклеточных включений, образования бляшек, реакций гемадсорбции и гемагглютинации; цветной реакции. ЦПД, или ЦПЭ, - видимые под микроскопом морфологические изменения клеток (вплоть до их отторжения от стекла), возникающие в результате внутриклеточной репродукции вирусов. В зависимости от особенностей репродуцирующихся вирусов ЦПД может различаться. В одних случаях быстро вакуолизируется цитоплазма, разрушаются митохондрии, округляются и гибнут клетки, в других формируются гигантские многоядерные клетки (так называемые симпласты) или наблюдается явление клеточной пролиферации, которое в итоге заканчивается деструкцией клеток. Таким образом, характер ЦПД позволяет использовать этот феномен не только для индикации вирусов, но и для их ориентировочной идентификации в культуре клеток. Другим проявлением ЦПЭ является образование внутриклеточных включений в ядре или цитоплазме зараженных клеток. Часто включения представляют собой скопления вирионов или их компонентов, иногда они могут содержать клеточный материал. Выявляют включения с помощью светового или люминесцентного микроскопа после окрашивания зараженных клеток соответственно анилиновыми красителями или флюорохромами. Включения могут отличаться по величине (от 0,2 до 25 мкм), форме (округлые или неправильные) и численности (одиночные и множественные). Характерные цитоплазматические включения формируются в клетках, инфицированных вирусом натуральной оспы (тельца Гварниери), бешенства (тельца Бабеша- Негри), а внутриядерные включения - при заражении аденовирусами или вирусами герпеса. 71 Бляшки, или негативные, колонии представляют собой ограниченные участки разрушенных вирусами клеток в сплошном монослое культур клеток (рис. 3.8). Они видны невооруженным глазом в виде светлых пятен на фоне окрашенного монослоя живых клеток. Добавление агара в питательную среду ограничивает распространение вирусов по всему монослою после выхода из разрушенной клетки и обеспечивает взаимодействие вирусов только с соседними клетками. Каждая бляшка образуется потомством одного вириона. Подсчитав количество бляшек, можно определить концентрацию вирусов в исследуемом материале. Кроме того, бляшки разных групп вирусов отличаются по размеру, форме, срокам появления. Поэтому метод бляшек используют для дифференциации вирусов, а также для селекции штаммов и получения чистых линий вирусов. Однако не все вирусы могут вызывать цитопатический эффект, тогда их выявляют другими методами. Рис. 3.8. Образование «бляшек» в культуре клеток, зараженных вирусом В основе реакции гемадсорбции лежит способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты. Целый ряд вирусов (гриппа, парагриппа и др.) обладают гемадсорбирующими свойствами, что позволяет использовать реакцию гемадсорбции для индикации этих вирусов даже при отсутствии выраженного ЦПД в культуре клеток. Механизмы реакции гемадсорбции и гемагглютинации сходны. Поэтому для обнаружения репродукции некоторых вирусов в культуре клеток можно использовать реакцию гемагглютинации с культуральной жидкостью, т.е. с питательной средой, содержащей размножившиеся вирусы. Присутствие в культуре клеток популяции вирусов можно также выявить с помощью цветной реакции, которая регистрируется по цвету индикатора питательной среды для культур клеток. При репродукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается (клетки гибнут) и среда сохраняет свой первоначальный цвет. Если же вирусы не размножаются в культуре клеток, то клетки, оставаясь жизнеспособными, в процессе метаболизма выделяют кислые продукты, изменяющие рН среды и соответственно цвета индикатора. |