Фармацевтическая

384
В 
адсорбционной 
хроматографии разделение веществ, входящих в смесь 
и движущихся по колонке в потоке растворителя, происходит за счет их раз-
личной способности адсорбироваться и десорбироваться на поверхности адсор-
бента с развитой поверхностью, например SiO
2
. 
В 
распределительной 
ВЭЖХ разделение происходит за счет различия в 
растворимости разделяемых веществ в НФ, как правило, химически привитой к 
поверхности неподвижного носителя, и ПФ-растворителе. Этот метод разделе-
ния наиболее распространен, особенно в случае, когда привитая фаза представ-
ляет собой неполярный алкильный остаток (С
8
–С
18
), а ПФ — более полярна, 
например является смесью СН
3
ОН или СН
3
СN с водой. Этим вариантом 
обра-
щённо-фазовой 
хроматографии в настоящее время проводят около 2/3 разде-
лений в ВЭЖХ. 
В 
ионообменной 
хроматографии молекулы вещества смеси, диссоции-
рующие на катионы и анионы в растворе, разделяются при движении через 
сорбент, на котором привиты катионные или анионные центры, способные к 
обмену с ионами анализируемых веществ за счет их разной скорости обмена. 
В 
эксклюзионной (ситовой, гель-проникающей, гель-фильтрацион-
ной) 
хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их раз-
ной способности проникать в поры носителя. При этом первыми выходят из 
колонки наиболее крупные молекулы (имеющие наибольшую молекулярную 
массу), способные проникать в незначительное число пор носителя. Последни-
ми выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в 
поры сорбента.
Следует иметь в виду, что в практической работе разделение часто проте-
кает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно. Так, адсорбци-
онное разделение бывает осложнено распределительными эффектами и нао-
борот. 
Жидкостно-адсорбционная хроматография
широко представлена в 
двух вариантах: нормально-фазная (НФХ) и обращенно-фазная (ОФХ) — 
в зависимости от полярности подвижной и неподвижной фаз. В нормально-
фазовой хроматографии используют полярный адсорбент (например, силика-
гель) и неполярный элюент (гексан, хлороформ и др.), а разделяемые вещест-
ва — полярные. В обращенно-фазовой хроматографии, как правило, адсорбент 
неполярный — силикагель с привитыми на его поверхности алкильными цепя-
ми (С
8
–С
18
), элюент полярный (спирты, ацетонитрил, вода), а разделяемые ве-
щества могут быть любой природы. Этим вариантом обращенно-фазной хрома-
тографии в настоящее время проводят около 2/3 разделений в ВЭЖХ. 
Растворители в порядке возрастания полярности располагаются следую-
щим образом: петролейный эфир, циклогексан, тетрахлорметан, бензол, метил-
хлорид, хлороформ, диэтиловый эфир, этилацетат, пиридин, ацетон, н-пропа-
нол, этанол, метанол, вода, уксусная кислота. 
По масштабу ВЭЖХ делится на 
микроколоночную
(колонки диаметром 
менее 2 мм), 
аналитическую
(2–6 мм), 
полупрепаративную
(7–10 мм), 
пре-
паративную
(10–40 мм) и 
крупномасштабную
(более 40 мм). 
374

385
3.4.1. СОСТАВ КОМПЛЕКСА ПО ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ 
ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ 
Принцип метода ВЭЖХ 
Анализируемую смесь растворяют в ПФ и с помощью дозатора или мик-
рошприца вводят в специальное устройство прибора. Туда же подаётся под оп-
ределённым давлением и с определённой скоростью ПФ. По мере продвижения 
ПФ с растворёнными в ней веществами за определённый промежуток времени 
на колонке происходит разделение смеси. Чем больше сродство компонента к 
НФ и чем меньше к подвижной, тем медленнее он движется по колонке и тем 
дольше он в ней удерживается. Анализ проводится в определённом режиме 
температур, что создаётся с помощью устройства для термостатирования. 
Растворитель (элюент) из емкости насосом подается в колонку. 
В зависимости от типа насоса поток жидкости при необходимости можно сгла-
дить демпфирующим устройством. В том месте, где давление может быть наи-
большим (обычно непосредственно за насосом), следует установить предохра-
нительный вентиль. Подвижная фаза (растворитель) после демпфирования по-
дается через устройство для ввода пробы в разделительную колонку. Давление 
на входе в разделительную колонку измеряют манометром, входящие из колон-
ки составные части пробы определяют с помощью детектора, хроматограмма 
регистрируется самописцем. Если составные части пробы необходимо выде-
лить, то элюат собирают с помощью коллектора фракций. Предусмотрена воз-
можность термостатирования узла для ввода пробы, колонки и детектора, что-
бы можно было работать при постоянной температуре, отличающейся от ком-
натной. ПФ (растворитель) до ввода пробы следует термостатировать при тем-
пературе колонки. 
Ввод пробы 
Анализируемые пробы тщательно подготавливают, используя мембран-
ные фильтры толщиной в несколько нанометров. Пробу вещества вводят в по-
ток элюента с помощью микрошприца через прокладку из специальных нена-
бухающих полимерных материалов в блок для ввода пробы (дозатор) или ис-
пользуют петлю для ввода пробы, из которой пробу вымывают в систему элю-
ентом. Часто используют дозатор с остановкой потока. Проба должна попадать 
в колонку без значительного смешивания с элюентом, т. е. ее нужно вводить 
шприцем непосредственно в начало разделительной колонки. Кроме того, дав-
ление или скорость потока в разделительной колонке при введении пробы не 
должны нарушаться. 
Ёмкость для элюента 
Объем сосуда составляет примерно 1000 мл. Емкость для элюента имеет 
нагреватель, регулятор температуры и магнитную мешалку. Пары элюента кон-
денсируются в холодильнике. Расположение и конструкция сосуда позволяют 
375

386
осуществлять легкую смену элюента. В комплекте прибора может быть не-
сколько емкостей. Система подачи элюента включает ряд дополнительных уз-
лов; систему дегазации, устройство для создания градиента (смеситель), насосы 
и измерители давления. Тщательная дегазация всех используемых растворите-
лей необходима ввиду того, что появление пузырьков газа в детекторе делает 
его использование невозможным. 
Насос 
Жидкостный хроматограф имеет достаточно сложное градиентное уст-
ройство, обеспечивающее отбор элюентов из 2–3 емкостей в смеситель, затем в 
колонку, а также дозаторы, работающие при высоких давлениях. 
Элюент должен подаваться в колонку при высоких давлениях, непре-
рывно и без пульсаций. Для аналитических работ (внутренний диаметр колонок 
до 5 мм) насосы должны обеспечивать подачу элюента со скоростью от 0,1 до 
10 мл/мин при давлении примерно от 200 до 300–500 атм. В некоторых микро-
колоночных хроматографах применяются насосы сравнительно низкого давле-
ния (до 10–20 атм). 
Хроматографическая колонка 
В качестве колонок используют чаще всего трубки из нержавеющей ста-
ли, а также стеклянные трубки длиной 10–25 см. Внутренний диаметр аналити-
ческих разделительных колонок составляет обычно 0,4–0,5 см. Они заполняют-
ся адсорбентом с диаметром частиц 5–10 мкм сферической или неправильной 
формы с помощью суспензионного метода, что дает возможность получить бо-
лее равномерную и плотную упаковку частиц сорбента в колонке. Заполнение 
колонки проводится при давлениях больших, чем рабочее давление в хромато-
графе. В микроколоночных хроматографах используются колонки меньшей 
длины и меньшего внутреннего диаметра (0,1–0,2 см и меньше). Частицы ад-
сорбента не должны разрушаться при заполнении колонки под большим давле-
нием. Плотная упаковка частиц адсорбента малого диаметра (5–10 мкм) в ко-
лонке позволяет получить высокоэффективное хроматографическое разделение 
компонентов смеси. Частицами диаметром менее 10 мкм заполняют только 
прямые колонки. Обычно длина таких колонок 10–50 см. Чаще всего разделе-
ние проводят в интервале температур 20–500
°
С, с точностью 
±
0,1
°
С. 
Адсорбент — это пористые частицы с различным размером пор. 
В качестве сорбента в ВЭЖХ используют чаще тонкоизмельченный силикагель 
(нормально-фазная хроматография) или его производные, полученные в ре-
зультате химической модификации силикагеля (обращенно-фазная хромато-
графия). Немодифицированный силикагель обладает высокими полярными 
свойствами. Силикагель с привитыми к поверхности С
8
–С
18
алкильными или 
другими функциональными группами обладает поверхностью, специфичной к 
различным классам разделяемых соединений. В ВЭЖХ в качестве сорбента в 
376

387
колонках часто используют «Сепарон С18» (силикагель с привитой алкильной 
группой с числом углеродных атомов, равным 18). 
Наполнительные материалы в ВЭЖХ могут иметь различную структуру, 
в зависимости от цели использования. Например, для препаративных разделе-
ний применяют полностью пористые частицы, обеспечивающие высокую ем-
кость, для аналитических разделений — пеликулярные частицы, обеспечиваю-
щие высокую эффективность. 
В качестве ПФ применяют жидкость, обладающую неполярными свойст-
вами, в случае НФХ и полярными при использовании ОФХ. Основной принцип 
при выборе ПФ: чем прочнее элюент адсорбируется на НФ, тем больше его 
элюирующая способность. Для элюента используются растворители наиболь-
шей степени очистки, а смешивание компонентов должно быть точным по мас-
се или объему. При НФХ разделение осуществляется в смеси органических не-
водных растворителей. Для этого метода предписывается применение осушен-
ных (безводных) растворителей — гексана, хлороформа, эфира, абсолютного 
этанола и др. Способы обезвоживания довольно трудоемки (перегонка над ме-
таллическим натрием, над специальными цеолитами, перегонка в вакууме). 
Использование обращенной фазы имеет ряд преимуществ по сравнению с 
немодифицированным силикагелем: лучшая воспроизводимость времен удер-
живания разделяемых компонентов, быстрая устанавливаемость равновесия 
системы. Обычно в качестве ПФ в ОФХ применяют смеси воды и органическо-
го модификатора — ацетонитрила, метанола, изопропанола, тетрагидрофурана 
и др. Вода должна подвергаться специальной очистке и иметь квалификацию 
«Для хроматографии». 
По качественным показателям разделения веществ, таким как число тео-
ретических тарелок, высокоэффективных теоретических тарелок, коэффициент 
емкости, селективность, разрешение, время выхода вещества, подбираются не-
обходимый состав и соотношение компонентов ПФ. 
Состав элюента может быть постоянным на протяжении всей хромато-
графической процедуры (
изократическое элюирование
) либо различным в со-
ответствии с установленной программой (
градиентное элюирование
). 
Пример хода анализа газированного напитка на предмет наличия в соста-
ве напитка консервантов — калия сорбата и натрия бензоата. 
Ход
 
анализа
: 
1) включить компьютер. Дождаться загрузки операционной системы. За-
пустить значок программы хроматографа; 
2) включить хроматограф. Дождаться запуска всех узлов высокоэффек-
тивного жидкостного хроматографа; 
3) приготовить калибровочные растворы с содержанием стандартного об-
разца анализируемого вещества с увеличением концентрации. Шаг увеличения 
концентрации можно выбрать любой, главное, чтобы был одинаков между пре-
дыдущим и последующим значениями концентрации, например 5 мг/мл; 
4) промывка хроматографического шприца на 100 мкл калибровочным 
раствором стандарного вещества с наименьшей концентрацией (рис. 343, 344), 
а также петли. Объём петли — 20 мкл. Необходимо ввести трехкратный избы-
377

388
ток раствора стандартного вещества, например 60 мкл. Шприц объёмом 
100 мкл. Затем трижды промываем петлю. В итоге — девятикратное промыва-
ние петли. Необходимо следить за тем, чтобы не было пузырьков воздуха в рас-
творах. Промывка делается трижды; 
Рис. 343.
Набор в хроматографический шприц раствора стандартного вещества 
с целью промывки петли с наименьшей концентрацией 
Рис. 344. 
Вкол раствора стандартного вещества в инжектор 
с целью промывки петли 
5) вкол калибровочного раствора с содержанием стандартных образцов 
анализируемых веществ начинают с наименьшей концентрации (рис. 345). По-
сле третьей промывки шприц хроматографический не вынимаем и поворачива-
ем от себя кран влево; 
378

389
Рис. 345.
Вкол раствора стандартного вещества с наименьшей концентрацией 
после трёхкратной промывки петли. Поворот крана инжектора влево до упора. 
Шприц остаётся в инжекторе 
6) поле диалогового окна хроматографической программы окрасилось в 
синий цвет, значит, начался процесс хроматографирования (рис. 346); 
Рис. 346.
Запуск процесса хроматографирования раствора стандартных веществ 
с наименьшими концентрациями
7) процесс градуировки по стандартам анализируемых веществ, например 
от 50 до 250 мг/мл по четырём точкам. Получим четыре точки для градуировки 
и введём две пробы, например анализу подвергается газированный напиток по 
двум консервантам: калия сорбат и натрия бензоат. Был приготовлен стандар-
ный раствор с известным содержанием кислоты сорбиновой и кислоты бензой-
ной в одном калибровочном растворе, так как их растворимость в воде очищен-
ной примерно одинакова. Хроматографический режим — изократический. Это 
означает, что состав подвижной фазы в процессе хроматографирования не из-
меняется. Обращённо-фазная хроматография. Это означает, что подвижная фа-
за более полярна, чем неподвижная фаза — сорбент в хроматографической ко-
379

390
лонке. Обращённо-фазная хроматография — это наиболее популярный вид 
ВЭЖХ в аналитической практике. 80% анализа ВЭЖХ проводится на обращён-
но-фазной колонке. В качестве подвижной фазы — элюента — в данном случае 
используется 22%-ный раствор ацетонитрила в воде очищенной, который под-
кислен ортофосфорной кислотой по методике. Все реактивы класса химически 
чистые (х. ч.) (рис. 347). По тефлоновому капилляру элюент попадает в магист-
раль выского давления хроматографического насоса. Есть две магистрали насо-
са: низкого и высокого давления. По линии низкого давления прокачивается 
20% этанол в качестве промывки. Промывка спиртом — это особенность дан-
ного насоса. Скорость расхода элюента — 1 мл/мин. Этот очень важный пара-
метр, обеспечивающий точность и воспроизводимость результата анализа. Если 
скорость расхода элюента в ходе хроматографирования будет меняться, то и 
время удерживания тоже будет меняться (рис. 348). 
Рис. 347.
Флакон с элюентом — 22%-ным раствором ацетонитрила 
Рис. 348.
Параметры хроматографирования: заданная скорость подачи элюента — 
1 мл/мин и параметр давления — 1717 psi. Длина волны 230 нм 
По трубке от насоса подвижная фаза попадает в инжектор, куда вставлен 
хроматографический шприц. Инжектор для ручного ввода пробы (рис. 349) ра-
ботает в двух режимах: ввода и загрузки. 
380

391
Рис. 349.
Инжектор для ручного ввода пробы 
В режиме загрузки элюент после насоса, минуя петлю, в которую мы за-
гружаем пробу, попадает сразу в хроматографическую колонку. И в этом поло-
жении мы может промывать петлю много раз. Петля стальная на 20 мкл (рис. 
350). И раствор, которым мы промываем, пойдёт на слив и не попадёт в колон-
ку. В режиме загрузки элюент попадает в петлю и уносит за собой пробу в хро-
матографическую колонку. 
Рис. 350.
Петля стальная на 20 мкл 
От инжектора также идут капилляры, маркированные разным цветом, ко-
торый обозначает диаметр капилляров. На основном тракте подачи элюента ка-
пилляры, как правило, разного диаметра. В паспорте на прибор есть подробные 
разъяснения по выбору диаметров капилляров. Капилляры с синей маркиров-
кой являются универсальными. 
Очень важно следить за давлением в системе, так как при превышении 
его может разорвать ячейку или обсыпится неподвижная фаза в хроматографи-
ческой колонке, которую уже не регенерировать, и она идёт на выброс. 
После инжектора либо элюент, или элюент с пробой попадают в систему 

жүктеу/скачать 66,35 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: