Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер
жүктеу/скачать 5,04 Mb. Pdf көрінісі
|
Kenzhebayeva (1) (1) (1)
| 1.9-cурет. Биологиялық зерттеулерде танымал ZEISS LIBRA
саңылаулы электрондық микроскопы (http://www.optec.zeiss.ru/electro/?n=23411973) Осы көрсетілген əдістерді пайдаланып, ең алдымен ядролык фракцияны сəйкестендіру (фазалық-контрастық микроскоп) керек. Митохондриялық бөлiктерді немесе үстірт рибосомоларымен қыртысты эндоплазмалық тордың көпіршіктерін морфологиялық жағынан жақсы анықтауға болады. Егер клетканың сыртқы мембраналардан пайда болған көпіршіктерінің диаметрі үлкен (шамамен 4 мкм) болса, олар- ды ішкі мембраналардан қалыптасқан кішілеу көпіршіктерден айыруға болады. Көпіршіктердің диаметрі 2 мкм-ден төмендеу болса, оларды морфологиялық жағынан анықтау мүмкіндігі болмайды. Микроско- пия арқылы дəрі-дəрмектерді, тағы басқа мембраналық құрылымдарды (мысалы, фибрилларды) анықтауға болады. 2. Мембраналардың липидтік құрамын анықтау. Бір түрлі мембра- наға липид-белоктың арақатынасы жəне липидтердің жиынтығы арнайы белгіленеді. Сондықтан бөлінетін мембраналық бөлiкшелі липидтердің құрамын анықтауға қажетті оның сипаттамасына байла- нысты кезең болады. Қазіргі таңда жоғары сатыдағы өсімдіктердің митохондриялық жəне вакуолярлық мембраналарының құрамын зерттеу үшін, жоғары 33 тиімді- сұйықтықты хроматография (ЖТСХ), газ сұйықтықты хрома- тография (ГСХ), УФ-спектроскопия əдістері қолданады. 3. Мембраналардың белоктық құрамын анықтау. Негізінде, бөлінетін мембраналық бөлшектерде əртүрлі молекулалық салмағымен белгілі белоктардың үлкен жиынтығы бар. Додецилсульфат натрий қатынасумен полакриламидті гель (ПААГ) электрофорезді қолданып, белоктардың құрамын немесе тазалау деңгейін анықтау белгілі мембрананың түрін сəйкестендіру үшін мүмкіндік береді. Соны- мен, саркоплазмалық тордың молекулалық массасы мен 100 кД бола- тын Са-АТФаза бұлшық ет ұлпаның микросомасы жалпы белоктың мөлшерінің 50-70%-ын құрайды. Плазматикалық мембраналарға гликопротеиндердің көп мөлшері тəн. Оларды арнайы бояулармен анықтауға болады. 4. Маркерлік ферменттердің белсенділігін анықтау. Егер фер- мент мембранамен ковалентті байланыстармен байланысса, осы фракция бөлінгенде ол бəсеңдемейді жəне тек осы органеллаларда кездеседі, сөйтіп, ол белгілі бір мембрананың түріне маркер ретінде қолданылады. Бірақ көптеген маркерлік ферменттер осы аталған талаптардың сəйкестігін көрсетпейді. Осы мембраналық фракцияның бөлу үдерісінде маркерлік ферменттердің белсенділігін зерттеп, бөлінген мембраналардың түрін дəл анықтауға болады. Көптеген маркерлік ферменттер (мысалы, Nа, К-АТФаза, 5'-ну- клеотидаза, сукцинатдегидрогеназа) бөлінгенде немесе сақталғанда белсенділігін жоғалтуы мүмкін. Сонымен қатар мембранаға біріктіріл- ген ферменттердің көпшілігінің активтік орталығы асимметрикалық орналасумен бейнеленеді. Осы себептерге байланысты жабық мембра- налық бөліктерде субстраттың қолжетімсіздігі нəтижесінде маркерлік ферменттердің белсенділігін анықтай алмаймыз. Бұл латентті белсенді деп аталатын ферменттердің күйі болады. Оны тек қана төмен кон- центрацияда детергенттердің немесе ионофордың (аламетицин түрі) қатынасумен анықтауға болады. Осы заттар жабық мембраналық көпіршіктерде (везикулаларда) ірі арналарда қалыптасады. Мүшелердің əртүрінде маркерлік ферменттердің мөлшері əртүрлі болады. Мысалы, глюкозофосфатаза көбінесе бауыр жəне бүйректің эндоплазмалық торында анықталады, ал басқа ұлпада осы ферменттер аз мөлшерде болады, сондықтан бір түрлі құрылымды бөліктерде мар- кер сəйкестігін анықтау мүмкін емес. 1.2-кестеде əртүрлі субклеткалық бөлшектерге тəн маркерлік ферменттердің түрлері келтірілген. 34 1.2-кесте Негізгі клеткалық бөлшектер жəне олардың атқаратын қызметтері [Эванс и др. 1990] Бөлшек немесе фракция Маркер Негізгі атқаратын қызметтері Ядро ДНҚ Хромосоманың орналасу аймағы, ДНҚ-тəуелді РНҚ- синтезі (транскрипция) Митохондрия Глутаматдегидрогеназа Лимон қышқылы циклі, АТФ- дың синтезі Рибосома РНҚ-ның жоғары мөлшері Белоктың синтезі (мРНҚ трансляциясы) Эндоплазмалық тор Глюкозо-6-фосфатаза Мембраналармен байланысқан рибосомолардағы белоктың синтезі. Əртүрлі липидтердің синтезі. Көптеген ксенобиотик- тің (Р-450 цитохроммен) тотығуы Лизосома Қышқыл фосфатаза Көптеген гидролазалардың əрекет орны Плазмалық мембрана Na/К + -АТРаза 5’-нуклеотидаза Клеткаға жəне клеткадан молекулардың тасымалдануы, клеткааралық адгезия жəне клеткааралық қатынастар Гольджи аспабы Галактозилтрансфераза Белоктардың ішкі клеткалық «іріктеуі». Гликозилану реак- циялары. Сульфаттау реак- циялары Пероксисома Каталаза, зəр қышқыл- дарының оксидазасы Кейбір май жəне амин- қышқылдарының ыдырауы. Сутегінің асқын қалыптасуы жəне ыдырауы Цитоқаңқа Арнайы маркер-фермент- тер жоқ Қорғаныштық қызметтері (майдафиламенттер, майдатү- тікшелер, аралық филамент- тер) Цитозоль Лактатдегидрогеназа Гликолиз үдерісі, май қышқылының синтезі 35 Сонымен, белгілі субклеткалық бөліктерді немесе оның та- залау деңгейін анықтау үшін əртүрлі əдістерді пайдалану қажет. Олардың көмегімен алынған нəтижелерді салыстыру керек. Маркерлік ферменттердің белсенділігін анықтап, бөлінген мембраналық фракция- ларды басқа қосындылармен сатпақ деңгейін бағалауға мүмкіншілік бар. жүктеу/скачать 5,04 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|