Решением Учебно-методического совета фгбоу дпо рманпо минздрава России «28» ноября 2016г
жүктеу/скачать 4,09 Mb. Pdf көрінісі
|
| Гибридизационный анализ. В основе метода лежит способность
нуклеиновых кислот к гибридизации – образованию двухцепочечных структур за счет взаимодействия комплементарных последовательностей нуклеотидов. Различают два типа гибридизационного анализа: методы гибридизационного анализа, проводимые в растворе (гомологичные); методы гибридизационного анализа, проводимые на твердом носителе (гетерогенные). Последние получили более широкое распространение в связи с тем, что имеют большую аналитическую чувствительность и специфичность, являются более технологичными, их проще стандартизовать и автоматизировать. Принцип метода основан на гибридизации зонда на твердой поверхности. В качестве твердой поверхности чаще всего используют полимерную нейлоновую мембрану. Анализ состоит из следующих стадий: пробоподготовка (выделение ДНК из образца); фиксация ДНК образца на мембране; гибридизация с ДНК-зондом, меченным флюорофором или ферментом; детекция результата. 140 В лабораторной практике применяется «сэндвич-технология». При этом подходе применяются 2 зонда, гомологичные различным участкам нуклеотидной цепи ДНК- или РНК-мишени. Один зонд фиксируют на мембране для того, чтобы связать искомую мишень, присутствующую в исследуемом образце. После осуществления гибридизации мембрану отмывают от исследуемого материала и добавляют раствор, содержащий второй зонд, который представляет собой коньюгат олигонуклеотида и какой-либо метки. Процесс гибридизации проводят повторно, при этом зонд с меткой взаимодействует с искомым участком ДНК (РНК). Детекция проводится в зависимости от природы метки ферментно-гибридизационным, радиографическим, авторадиографическим, флюоресцентным или хемилюминесцентным методами. Преимущество этого подхода заключается в том, что практически сведены к минимуму подготовка клинического материала и очистка нуклеиновых кислот. В современных наборах реагентов, предлагаемых для диагностических исследований, применяется хемилюминесценция, которая обеспечивает чувствительную детекцию результатов гибридизации. Технология автоматизирована, время выполнения анализа составляет 2,5-3 ч. По мере миниатюризации соответствующих носителей-подложек для гибридизации в практику вошли микрочипы (microarrays) с сотнями и тысячами ДНК-зондов для выявления практически любых известных генов, их вариантов и мутаций. Часто для гибридизации применяют не исходные нуклеиновые кислоты, а продукты амплификации целевых генов. Учет результатов гибридизации на биочипах осуществляется посредством оптических устройств, предлагаемых кампанией-разработчиком. жүктеу/скачать 4,09 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|