С курсом факультета повышения квалификации и переподготовки кадров
жүктеу/скачать 2,61 Mb. Pdf көрінісі
|
Часть 2. Частные вопросы биотехнологии. Клеточная биотехнология 110 4) введение реконструированной плазмиды в E. coli; 5) идентификация рекомбинантных бактерий. Полученный штамм E. coli используют в процессе ферментации. В ферментер загружают питательную среду и засевают трансгенную культуру E. coli. Ферментация осуществляется в L-бульоне или среде М9 (содержит NaCl, фосфаты, глюкозу, CaCl 2 , MgSO 4 ) при 30ºС, рН составляет 6,8–7,0. Культуральную жидкость и биомассу отделяют центрифугированием. Далее биомассу замораживают до температуры не выше минус 70ºС с последующим размораживанием. Клетки обрабатывают 1–2 % раствором лизоцима для разрушения клеточных стенок. В лизат добавляют ДНК-азу для удаления ДНК и РНК при комнатной температуре в течение 1 часа. Нерастворимую форму ИНФ очищают отмывкой буферным раствором с детергентами (полиэтиленамин). Осадок ИНФ отделяют центрифугированием и растворяют в 6М растворе гуанидина гидрохлорида. Проводят высаливание ИНФ из супернатата добавлением (NH 4 ) 2 SO 4 . Очистку от (NH 4 ) 2 SO 4 проводят при помощи диализа. Далее следует ренатурация белка в буферном растворе с детергентами (Твин-20, Тритон Х-100, Тритон Х-114, полигистидин) и его одностадийная очистка при помощи ионообменной хроматографии (на смолах типа Ватман СМ-52, целлюлоза). Недостатком данного способа является низкая технологичность процесса очистки и нестабильность штамма при работе в производственных условиях. На сегодняшний день наиболее эффективной является очистка интерферонов при помощи аффинной хроматографии (следует за этапом ренатурации белка). Вместе с тем, этот способ очистки является дорогостоящим. жүктеу/скачать 2,61 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|