С курсом факультета повышения квалификации и переподготовки кадров
жүктеу/скачать 2,61 Mb. Pdf көрінісі
|
Глава 10. ПОЛУЧЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ЦИТОКИНОВ (ИНТЕРФЕРОНЫ) 109 Фибробластный интерферон получают от культур диплоидных эукариотических клеток, поскольку они способны осуществлять процесс гликозилирования белка. Максимальный выход интерферона наблюдается при использовании синтетической двунитчатой РНК. Человеческий лимфобластоидный интерферон (смесь ИНФ-α и ИНФ-β) получен из лимфоидных клеток инфильтрата плевры больных лимфомой Беркита. Для индуцирования синтеза такого интерферона также используется вирус Сендай. Иммунный интерферон (ИНФ- ) синтезируют В- и Т-лимфоциты. Его получают от кратковременных культур Т- и В-лимфоцитов. Выход этого интерферона ниже, чем альфа- и бета-интерферона. В настоящее время более перспективным признан способ получения ИНФ микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию. Из клетки человека изолирован ген, ответственный за биосинтез ИНФ, который используют при создании трансгенных микроорганизмов. В качестве исходных микроорганизмов используют штаммы Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli. Недостатком штамма P. pastoris является низкий уровень выхода целевого продукта на грамм биомассы, а штамма P. putida – сложность выделения конечного продукта. Наиболее продуктивным является использование штаммов Escherichia coli. В качестве продуцента чаще всего используют штамм E. coli SS5, полученный с помощью рекомбинантной плазмиды pSS5. Экспрессия ИНФ штаммом E. coli SS5, содержащим эту плазмиду, контролируется тремя промоторами: Plac, Pt7 и Ptrp. Уровень экспрессии ИНФ составляет около 800 мг на 1 л клеточной суспензии. Рассмотрим более подробно технологический процесс получения человеческого рекомбинантного ИНФ-α. На первом этапе проводят создание рекомбинатного штамма E. coli: 1) индукция синтеза ИНФ в культуре клеток (лейкоциты человека) и выделение мРНК; 2) получение кДНК, комплементарной мРНК, которая кодирует информацию об ИНФ; 3) встраивание кДНК в плазмиду pSS5; |