Контроль  качества  лекарственных  средств  на

Глава  10.  ПОЛУЧЕНИЕ  ЛЕКАРСТВЕННЫХ  СРЕДСТВ  НА  ОСНОВЕ 
ЦИТОКИНОВ (ИНТЕРФЕРОНЫ) 
 
 
111 
 
Определение специфической активности 
Противовирусная  активность.  Должна  составлять  от  2×10
7
  до 
2×10
8
 МЕ/мл.  Определение  осуществляют  в  первичной  культуре  клеток 
кожно-мышечной  ткани  эмбрионов  человека,  в  перевиваемой  культуре 
клеток  почки  быка  (МДВК)  или  другой  перевиваемой  культуре  клеток, 
высокочувствительных  к  интерферону  альфа-типа,  в  сравнении  со  2-м 
международным  стандартом  ВОЗ  рекомбинантного  человеческого 
интерферона альфа 2b (95/566) или другого аналогичного стандарта.  
Клетки  выращивают  в  виде  монослоя  в  стеклянных  матрацах 
вместимостью  0,5  л.  Для  культивирования  клеток  используют 
питательную среду 199 или RPMI 1640 с 10 % телячьей сыворотки (среда 
№ 1), 100 ед/мл пенициллина и 10 ед/мл гентамицина. 
Тестирование выполняют в 96-луночных плоскодонных пластиковых 
планшетах.  Для  засева  используют  3–4  суточную  культуру  с  вполне 
сформированным  клеточным  монослоем.  Клетки  суспендируют  в  10  мл 
среды 199 или RPMI 1640 с 5 % телячьей сыворотки. Отбирают пробу для 
подсчета  количества  клеток  в  1  мл  среды  в  камере  Горяева.  Суспензию 
клеток  разводят  средой  таким  образом,  чтобы  в  1  мл  содержалось  около 
5×10
5
 клеток. 
Образцы  исследуемой  субстанции  разводят  в  5 %  телячьей 
сыворотке.  Сначала  готовят  десятикратные  разведения  до  концентрации 
10
-3
,  а  затем  непосредственно  в  лунках  планшета  в  объеме  0,1  мл  делают 
двукратные разведения до разведения, близкого к предполагаемому титру 
активности.  Параллельно  разводят  рабочий  стандартный  образец  (СО), 
активность которого выражена в международных единицах активности. На 
каждое  разведение  используют  не  менее  четырех  лунок.  Четыре  лунки 
оставляют  для  контроля  клеток,  шестнадцать  –  для  контроля  дозы 
индикаторного вируса. 
Затем к каждой из 96 лунок вносят по 0,1 мл клеточной суспензии в 
концентрации  (5±1)×10
5
  клеток  в  1  мл  среды.  Планшеты  с  опытными  и 
контрольными  культурами  инкубируют  на  протяжении  24  часов  при 
температуре (37,0±1,0)ºС в атмосфере (5±0,5) % СО
2
 и (70±5) % влажности. 
После  этого  среду  из  лунок  удаляют.  К  каждой  лунке  с 
исследуемыми  материалами  вносят  предварительно  определенную  дозу 
вируса  везикулярного  стоматита,  которая  соответствует  100  условным 
единицам  активности  в  0,1  мл.  Одновременно  осуществляют  контроль 
взятой  дозы  вируса  на  предназначенных  для  этой  операции  шестнадцати 

жүктеу/скачать 2,61 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: