Сабақ. Молекулалық-генетикалық зерттеу әдістері Ақпараттық-дидактикалық блок
жүктеу/скачать 268,83 Kb.
|
|
№18 сабақ. Молекулалық-генетикалық зерттеу әдістері Ақпараттық-дидактикалық блок. Геномика - тірі организмдер геномдарының нуклеотидтер тізбегінің құрылымы мен қызметін кең мағынада зерттейтін биология саласы болып табылады. Геномика ғылымының бірнеше тармақтары бар: құрылымдық геномика - нуклеотидтер тізбегі, олардың модификацияларының болуы, ақуыздармен өзара әрекеттесуі, функционалдық геномика - генетикалық ақпаратты іске асыру, жүйелі геномика-тірі организмдердің жүйелі орнын нақтылау үшін ДНҚ-ның белгілі бір учаскелерінің тізбегін пайдалану. Геном-тұқым қуалайтын ақпаратты кодтайтын организм жасушасының бүкіл ДНҚ жиынтығы. Тиісінше, генономика деп геномның құрылымын, ұйымдастырылуын және қызметін, сондай-ақ әртүрлі организмдердің геномдарының эволюциясын және оларды бір-бірімен салыстыруды зерттейтін молекулалық биологияның бөлімі ретінде қарастырылды. Молекулалық филогенез геномика деректеріне де негізделген. Геномика терминін алғаш рет американдық генетик Томас Родерик 1986 жылы геномдарды картаға түсіру, ретке келтіру және сипаттау бойынша жиынтық зерттеулерге сілтеме жасау үшін қолданған. 1972 жылы американдық ғалым Пол Берг әріптестерімен бірге фаг, бактериялық және вирустық ДНҚ фрагменттерінен тұратын рекомбинатты (гибридті) ДНҚ молекуласын in vitro (организмнен тыс) алу туралы алғашқы жұмысын жариялады. Осылайша генетикалық инженерия деп аталатын молекулалық биологияның жаңа саласы дүниеге келді. Оның мақсаты-жаңа генетикалық құрылымдарды құру және жаңа тұқым қуалайтын қасиеттері бар организмдерді жасау. Қазіргі уақытта көптеген молекулалық биология мамандары үшін рекомбинантты ДНҚ әдістері-генетикалық инженерияның негізі болып табылады. Гендік инженерия ұғымына келесі анықтамаларды қолдануға болады: Гендік инженерия әдістерін қолдану алдын-ала белгіленген бағдарлама бойынша организмнен тыс молекулалық генетикалық жүйелерді жобалауды, содан кейін оларды тірі ағзаға енгізуді қамтиды. Бұл жағдайда рекомбинантты ДНҚ реципиент ағзасының генетикалық аппаратының құрамдас бөлігіне айналады және оған жаңа бірегей генетикалық, биохимиялық, содан кейін физиологиялық қасиеттерді хабарлайды. Рекомбинантты ДНҚ технологиясы келесі әдістерді қолданады: - ДНҚ-ны белгілі бір жерлерде "кесетін" арнайы ферменттермен (рестрикторлы нуклеазалар – рестриктазалар) ДНҚ-ның спецификалық ыдырауы, бұл жеке гендердің оқшаулануы мен манипуляциясын тездетеді; - тазартылған ДНҚ фрагментіндегі нуклеотидтер тізбегін (секвенирлеу) жылдам анықтау, бұл ген шекараларын және онымен кодталған аминқышқылдарының тізбегін анықтауға мүмкіндік береді; - рекомбинантты ДНҚ құрылысы; - нуклеин қышқылдарының гибрадизациясы, комплементарлы азотты негіздердің нақты өзара әрекеттесу қабілетіне негізделген, бұл әдіс РНҚ немесе ДНҚ-дағы нуклеотидтердің нақты тізбегін үлкен дәлдікпен және сезімталдықпен анықтауға мүмкіндік береді; - ДНҚ клондау: полимеразды тізбекті реакция арқылы in vitro жағдайда амплификациялау немесе бактерия жасушасына ДНҚ фрагментін енгізу, ол осындай трансформациядан кейін бұл фрагментті миллиондаған көшірмелерде қайталайды; - рекомбинантты ДНҚ-ны жасушаларға немесе организмдерге енгізу. Гендік инженерияның материалдық негізі келесі жаңалықтармен байланысты болды. Микроорганизмдерден рестриктаза ферменттерін оқшаулау, олар ДНҚ молекулаларын және кез-келген ДНҚ фрагменттерін біріктіре алатын лигаза ферменттерін дәл сол жерде кесіп тастай алады. Осылайша, ғалымдар генетикалық аппаратты манипуляциялау үшін ерекше молекулалық қайшылар мен желім алды. ДНҚ фрагменттерін эукариоттардың геномынан арнайы таңдалған рестриктазалармен кесуге болады және сол рестриктазалармен кесілген ПЛАЗМИДА немесе вирустың ДНҚ-сына енгізуге болады. Плазмидалар бактерия жасушаларында кездесетін және жасуша хромосомаларына қарамастан репликация мен транскрипцияға қабілетті дөңгелек, қос тізбекті ДНҚ молекулалары. Гибридті плазмида немесе рекомбинантты ДНҚ түзіледі. Алайда, осылайша рекомбинантты ДНҚ-ның өте аз мөлшері алынады. Ол үшін рекомбинантты плазмидалар бактерияларға енгізіліп, "бөтен" гендерді репликациялайтын, транскрипциялайтын және аударатын рекомбинантты бактериялар алынады. Рекомбинантты ДНҚ алу Бактериялық массадан рекомбинантты ДНҚ-ның жеткілікті мөлшерін бөліп алуға болады. Генетикалық инженерия арқылы микроорганизмдер жүздеген тонна адам гормонын - инсулин мен интерферонды шығарады. Трансформацияланған E. Coli жасушаларында препроинсулин синтезінің схемасы. Молекулалық генетикалық әдістер зерттелінетін ДНҚ молекуласының нақтылы учаскесінің (аллель, ген) құрылымының ерекшеліктерін анықтауға бағытталған зерттеу әдістері болып табылады. Бұл әдістер ДНҚ және РНҚ молекулаларын тәжірибелік зерттеулерге негізделінеді. Қазіргі кезде молекулалық биология, генетика жетістіктері, адам геномын зерттеулер, молекулалық генетикалық әдістерін медицина практикасында кеңінен қолдануға мүмкіндік туғызды. ДНҚ (РНҚ) үлгісін алу жасушадағы ДНҚ молекуласын бөліп алу не полимеразалық тізбектік реакция (ПТР) арқылы жинақтау. ДНҚ молекуласын кез келген ядролы жасушалардан бөліп алуға болады. Ол ағзаның біртұтас геномы болғандықтан оны геномдық ДНҚ деп атайды. Әдетте, ДНҚ молекуласын лейкоциттерден, хорион жасушаларынан, амнион сұйықтығының жасушаларынан, фибробласт культурасынан бөліп алады.Бір рет талдау жасау үшін бірнеше нанограммнан бірнеше микрограмммға дейін ДНҚ қажет. Ол үшін 20-40 мг. хорион, 1мл қан, 5-10мг қолдан өсірілген жасушалар қажет. Ауруларды дұрыс анықтау не гетерозиготалық күйін анықтау үшін геномның кішкентай фрагментін зерттеудің өзі жеткілікті, тек осындай фрагменттерді жеткілікті мөлшерде көшірмелеп көбейту (амплификация) қадет. Бұрын бұл процесс бірнеше саты арқылы жүргізілетін: рекомбинантты плазмида құрастыру, оны бактерия жасушасына енгізу, бактерияны көбейту, ДНҚ фрагменттерін бөліп алу. Қазіргі уақытта қажетті ДНҚ фрагментін полимеразалық тізбектік (ПТР) реакция арқылы жеп жеңіл жүзеге асады. Бұл реакцияны америка ғалымы К. Мюллис ашты. ПТР ДНҚ ны амплификациялау, яғни көшірмелерін көбейту. Бірнеше сағат ішінде ДНҚ ның кез келген бөлшектерін (бір генге дейін) миллиондаған дана күйінде көбейтуге мүмкіндік береді. ПТР жүргізу үшін көбейтілетін ДНҚ фрагментінің нуклеотидтер бірізділігін күні бұрын білу қажет. Зерттелінетін ДНҚ учаскесіеің 5 және 3 ұштарының нуклеотидтер бірізділігіне сәйкес 20-30 нуклеотидтен тұратын екі олигонуклеотидтік праймерлер (РНҚ ұйытқы) синтезделінеді. ДНҚ фрагментін амплификациялау процессі қайталанатын циклдардан тұрады: жылылықпен әсер етіп (94С) ДНҚ молекуласын жеке тізбектерге ыдырату (данатурациялау); бір тізбекті ДНҚның негіздеріне комплиментарлы праймерлерді байланыстыру (37С-68С); ДНҚ полмераза ферментінің қатынасуымен жаңа ДНҚ тізбегін синтездеу (72 С) ДНҚ молекуласын фрагменттерге бөлшектеу (рестрикциялау) рестриктазалар арқылы ДНҚ молекуласын ұзынды қысқалы фрагментерге кесу. Рестриктаза қос тізбекті ДНҚ молекуласының 4-6 жұп нуклеотидтер бірізділігін танып кеседі де, фрагменттерге бөлшектейді. Кесте 1. Рестриктазалар мен олардың ыдырататын тізбектері
ДНқ фрагменттерінің электрофарезі рестриктазалар арқылы кесілген фрагменттер агрозды не полиакриламидті гель бетінде өлшемдеріне қарай түрліше таралып үлестіріледі, яғни молекула массасы үлкен фрагменттер тез қозғалады. Электрофорез аяқталған соң ДНҚ фрагменттері гель бетіне әртүрлі орындарда орналасады. ПТР дан кейін ДНҚ фрагменттерін визуальді зерттейді, ол үшін агроздық гелде электрофорез жүргізеді. Содан кейін гельді этидий бромидимен өңдейді. Этидий бромиди ДНҚ мен байланысып, гель бетін ультракүлгін сәулесімен сәулелегенде, спектрдің қызыл учаскесінде жарқырау байқалады. Сол жарқыраулар зерттеуге қажет ДНҚ фрагменті болып табылады. Адам геномы үлкен болғандықтан рестрикция нәтижесінде көптеген рестрикция фрагменттері түзіледі және оны электрофорезден кейін оларды этидий бромидимен бояғанда ультракүлгін спектрінде ДНҚ фракцияларының бәрі біркелкі боялады. Сондықтан, ДНҚ ның ерекше фрагменттерін бөліп алып зерттеу Саузерннің блот гибридтеу әдісі арқылы жүргізіледі. Бұл әдіс мына кезеңдерден тұрады. Электрофорезден кейін гельді сілті ерітіндіге енгізеді, бұл кезде қос тізбекті ДНҚ молекуласы бір тізбекті болып ыдырайды ДНҚ фрагменттерін буферлік ерітінді көмегімен нитроцеллюлозалы не нейтронды фильтрге ауыстыру. Ол үшін гель бетін фильтрмен және бір бума фильтрлеуші қағаздармен жабады. Капиллярлық эффект нәтижесінде гель бетіне перпендикуляр буферлік ерітінді ағыны пайда болады. Гельден бөлініп шыққан ДНҚ фрагменттерінің бәрі фильтрде ұсталынып қалады. ДНҚ фрагменттерінің фильтрде орналасу реті олардың гельдегі орналасуына дәлме дәл болады. Қажет фрагменттерді визуальді табу үшін ДНҚ фрагменттерін радионуклид не флюроценттік таңбамен таңбаланған синтетикалық олигонуклеотидтік зонд бірізділігімен гибридтейді. Әрбір зонд 16-30 жұп негіздерден тұрады. Зонд нуклеотидтерінің бірізділігі зерттелуші геномдық ДНҚ фрагментімен толық не ішінара комплиментарлы болуы қажет. Таңбаланған зонды бар ерітіндімен фильтрді әрекеттестіргенде ДНҚ фрагменттерімен ДНҚ зонд тізбектері комплиментарлы будандасады.. Радиоактивтік таңбамен таңбаланған будан учаскелерін рентгенмен зерттегенде (ауторадиография) зерттелуші ДНҚ фрагменттері айқын байқалады Мутацияларды диагностикалаудың тура әдістері. Қазіргі кезде ДНҚ диагностикасының екі әдісі қолданылады: белгілі мутацияларды детекциялау; мутациялық скрининг әдістері. Белгілі мутациялрды детекциялау, егер мутация белгілі болса, онда оларды фермент рестриктаза арқылы кесіп рестрикциялық талдау не ДНҚ гибридизациясы арқылы табуға болады. Мутациялық скрининг әдісі егер мутация сипаты белгісіз бірақ аурудың клиникалық көрінісі қандай генде мутация пайда болғанын болжамдауға мүмкіндік беретін болғанда жүргізілетін әдіс. Олардың түрлері: саузерн блот гибридизация арқылы қайтақұрылымды талдау; бір тізбекті ДНҚ молекуласының конформация полиморфизмін талдау; денатурант градиентінде қос тізбекті ДНҚ электрофорезі; гетеродуплексті талдау жүктеу/скачать 268,83 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|