Сабақ. Молекулалық-генетикалық зерттеу әдістері Ақпараттық-дидактикалық блок
жүктеу/скачать 268,83 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Саузерн – блот гибридизация әдісі
| ДНҚ блоттинг әдісі дегеніміз не?
"Блоттинг" (Blot) термині ақуыздар мен нуклеин қышқылдарын молекулалық зерттеудің әртүрлі түрлерін біріктіреді. Бұл әдіс қажетті үлгілерді бөлуге, тасымалдауға және анықтауға мүмкіндік береді, бұл қажетті элементтерді зерттеу жұмысын айтарлықтай жеңілдетеді. Блотинг үш негізгі қадамнан тұрады: 1. бөлу (separate), полимер геліндегі ақуыздар немесе қышқылдар қоспалары электрофорез арқылы өңделген кезде; 2. тасымалдау (transfer), бөлінген молекулалар әдетте нитроцеллюлозадан немесе PVDF-тен жасалған дайындалған мембраналарға ауысқанда; 3. анықтау (detect), үлгілер иммунохимиялық әдістермен, бояумен немесе авторрадиографиямен таңбаланған кезде. Блоттинг әдісінің түрлері Блотинг әдісін британдық молекулярлық биолог Эдвин Саузерн дайындаған, сондықтан техниканың бірінші түрі Southern blotting деп ғалымның атымен аталған. Ғалым өзінің осы жаңалығы үшін 2005 жылы Ласкер сыйлығымен марапатталған. Southern blotting үлгідегі белгілі бір ДНҚ тізбегін анықтауға мүмкіндік беретін әдіс, бұл блоттинг әдістерінің ішіндегі ең біріншісі болды, кейінгі барлық әдістер осы әдіске негізделіп жасалған; саузерн-вестерн блотинг ДНҚ-мен тікелей байланысты белоктарды анықтау және визуализациялау үшін қолданылады; Northern blotting РНҚ-дағы белоктардың ретін анықтауға көмектеседі; Western blotting үлгідегі нақты ақуыздардың болуын анықтауға мүмкіндік береді; Истерн блотинг - үлгідегі трансляциядан кейінгі ақуыз модификацияларын анықтау әдісі. Саузерн – блот гибридизация әдісі Гендер жинағынан бөлінгенДНҚ сегментін қайтадан әр түрлі рестриктазалармен үзеді, осының нәтижесінде ұзындығы бойынша әр түрлі рестриктер немесе ДНҚ үзінділері алынады. Алынған үзінділерді электрофорезден өткізеді, мұның нәтижесінде олар агарозалық гельде ұзындығына сәйкес таралады: үзінді қысқа болған сайын, ол электр өрісінің әсерінен агарозалық гельде жылдам қозғалады. Осындай гельді бром этидиімен бояп, оның суреті бойынша рестрикттердің ұзындығын анықтайды. Бұдан кейін жауапты кезең — ДНҚ-ны денатурациялау арқылы жалғыз тізбекті үзінділер алып, оларды нитроцеллюлозалы сузгіге ауыстыру басталады. Ол үшін электрофорез аяқтала салысымен агарозалық гельді тұздың қанықтырылған ерітіндісіне батырып, сүзгі қағаздың үстіне орналастырады. Гельді нитроцеллюлозамен жабады, ал олардың үстіне бірнешн құрғақ сүзгі қағаздарын салып престейді. Тұз ерітіндісі құрғақ сүзгі қағазына сіңеді, ол үшін ерітінді гельден, онан соң нитроцеллюлозалы сүзгіден өтуі керек. Гельдегі ДНҚ үзінділері ерітіндімен бірге тасымалданады, бірақ нитроцеллюлозалы сүзгіде тұтылып бекінеді. ДНҚ үзінділерінің нитроцеллюлозалы сүзгідегі орындары электрофорез пластинкасындағы орналасу тәртібіне дәлме-дәл келеді. Сонымен электрофорездегі рестриктер таңбасы нитроцеллюлозалы сүзгіде алынды. Бұл әдісті Саузерн Э. ұсынды, сондықтан ол Саузерн блотинг (ағыл. to blot— қағазға сорылу) деп аталады. Саузерн бойынша блотинг әдісінің маңызы жалпы геномнан жеке гендерді бөлуде арта түседі. Бұл молекулалық деңгейдегі күрделі жұмыс үлкен мұқияттылықты керек етеді. Мысалы, сүтқоректілер клеткасының геномы 109 н.ж. құралған болса, онда ұзындығы тіпті 5000 н. ж. тең жалғыз ген геномның бар болғаны ядролық ДНҚ-ының 0,00005 %-ін ғана құрайды. Әдісті РНҚ үшін де қолдануға болады. Мұнда гибридизация өткізу үшін бірқатар өзгерістер енеді. Бұл әдіс Нозерн блотинг деп аталады (Саузерн — оңтүстік деген мағынаны білдірсе, керісінше Нозерн-солтүстік әдісі де-ген атау пайда болды). Қалған операциялар генотеканың скринингісіндей өтеді: нитроцеллюлозалы сүзгіде ДНҚ денатурацияланып, радиоактивті сүңгімен гибридизацияланады және қажет ген орналасқан ДНҚ үзінділері радиоаутографияның көмегімен табылады. Вестерндік блотинг - бұл белокты қоспадан белгілі бір ақуызды антиденені қолдану арқылы анықтау әдісі. Сондықтан батыс блот жүктеу/скачать 268,83 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|