а) гибридизация последовательностей с мечеными соответствующими последовательностями олигонуклеотидов (радиоактивными, или флуорсицентыми метками).
б) амплификация (увеличение копий) последовательностей нуклеиновых кислот; при этом они многократно копируется и созданные копии можно детектировать различными методами.
Гибридизация нуклеиновых кислот – основа для ДНК тестирования
В основе гибридизации нуклеиновых кислот лежит принцип комплементарности ДНК (А=Т; Г=Ц), а также свойства ДНК при измененной рН и повышенной температуре (50-60 0С)– денатурировать (расплетаться на две нити). Процесс денатурации обратим. Это свойство ДНК позволяет идентифицировать олигонуклеотидные последовательности и их полиморфизмы.
Полимеразная цепная реакция
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) заключается в циклическом синтезе in vitro строго заданных, ограниченных участков ДНК длиной от десятков до нескольких тысяч п.о. Это позволяет в течение 3-5 часов получить огромное число копий искусственно синтезированных молекул нужной последовательности ДНК (т.е. амплифицировать необходимый участок ДНК, являющийся предметом молекулярного анализа). По сути, метод ПЦР «имитирует» на ограниченном участке гена естественный процесс репликации ДНК, имеющий место in vivo: в состав реакционного раствора с определённой концентрацией ионов магния и pH входит ДНК-матрица, четыре вида дезоксирибонуклеотид-трифосфатов, а также термостабильная ДНК-полимераза, сохраняющая свою активность при нагревании раствора до высоких температур (Горбунова В.Н. 1999). Реакция инициируется добавляемыми в раствор праймерами – олигонуклеотидными последовательностями, фланкирующими «зону интереса» и играющими роль затравок в процессе комплементарного синтеза ДНК.
