Учебное пособие по химии для самостоятельной работы студентов медицинских вузов Рекомендуется для студентов, обучающихся по специальностям
Молекулярно-абсорбционная спектрофотометрия
жүктеу/скачать 1,06 Mb.
|
Физико-химические методы (1)
| 2.3.2.2. Молекулярно-абсорбционная спектрофотометрия
Абсорбционная спектрофотометрия основана на измерении поглощения света молекулами. Молекулярный спектр поглощения возникает вследствие изменения энергии молекулы под действием излучения. Энергия молекулы состоит из трех составляющих: энергии движения электронов Еэл, энергии колебания атомов в молекуле Екол и энергии вращения молекулы Евр. Изменение энергии молекулы в результате поглощения излучения Е будет сопровождаться изменением всех этих составляющих: Е = Еэл + Екол + Евр Анализ электронных спектров, лежащих в видимой и ближней ультрафиолетовой областях, применяется для определения переходных металлов и органических соединений с окрашивающими (хромофорными) группами. Поскольку энергия поглощённого фотона зависит от частоты колебаний или длины волны света , каждому электронному переходу соответствует строго определённая частота и длина волны поглощаемого света. Поэтому спектр поглощения молекул, находящихся в газообразном состоянии, является линейчатым. Но в растворе вследствие взаимодействия молекул растворённого вещества с молекулами растворителя (воды) линейчатые спектры молекул размываются: вместо линий появляется полоса поглощения. Полосы поглощений могут иметь один или несколько максимумов. Например, в спектре поглощения хлорофилла (рис. 26) два максимума при длинах волн = 433 нм и = 642 нм отвечают очень интенсивному поглощению в синем и красном диапазонах видимого света. Поэтому для человеческого глаза хлорофилл оказывается зелёным, т. е. имеет цвет той части спектра, которая им не поглощается или поглощается слабо. Для анализа необходимо использовать поглощение в той части спектра, где этот процесс происходит наиболее интенсивно. Для этого раствор с анализируемым веществом облучают светом с той длиной волны, которая в наибольшей степени им поглощается. Тогда по степени поглощения света можно количественно определить содержание вещества в растворе. Рис. 26. Спектр поглощения хлорофилла. Для проведения анализа методом абсорбционной спектрофотометрии служат приборы: фотоколориметры и спектрофотометры. В фотоколориметрах для выделения области спектра, соответствующей максимальному поглощению, используют светофильтры, которые пропускают не свет с определённой длиной волны, а полосу света; обычно фотоколориметры снабжены набором светофильтров, охватывающих диапазон с 315 до 980 нм. Их достоинство простота, недостаток пониженная точность определения, вызванная отсутствием монохроматичности излучения. В спектрофотометрах применяют монохроматоры, представляющие собой дифракционную решётку и позволяющие выделять из спектра излучения узкий участок (порядка 1 нм), что повышает точность измерений. Кроме того, благодаря наличию нескольких источников излучения и приёмников световой энергии появляется возможность снять полный спектр поглощения данного раствора при длинах волн от 210 до 2500 нм, что важно для определения максимума поглощения. Пробу анализируемого вещества переводят в раствор, а затем, если это вещество не окрашено, переводят анализируемое вещество в окрашенное соединение. К такой фотометрической реакции предъявляются жёсткие требования: она должна быть избирательной (чтобы другие компоненты раствора не образовывали окрашенные соединения), чувствительной (чтобы перевести в окрашенное соединение даже малые концентрации анализируемого вещества), хорошо воспроизводиться от опыта к опыту и обеспечивать получение окраски, устойчивой во времени. Кроме того, важно, чтобы закон Бугера-Ламберта-Бера соблюдался в широком интервале концентраций. Указанным требованиям удовлетворяют окрашенные аквакомплексы катионов металлов: меди Cu2+ (голубой), никеля Ni2+ (зелёный), хрома Cr3+ (сине-фиолетовый), кобальта Co2+ (розовый) и др., а также ряд анионов кислородсодержащих кислот: перманганата MnO4 (фиолетовый), хромата CrO42 (жёлтый), дихромата Cr2O72(оранжевый) и др. Но определение большинства элементов проводят в виде окрашенных комплексных соединений; например, определение меди проводят в виде ярко-синего комплексного соединения [Cu(NH3)4]2+; кремний, фосфор, мышьяк определяют в виде гетерополикислот с молибденом или вольфрамом (обычно жёлтого или синего цвета); соли аммония определяют с помощью щелочного раствора дигидрата тетрайодомеркурата (II) калия K2[HgI4]2H2O, образующего соединение жёлтого цвета HOHgNHHgI. Металлы чаще всего определяют в виде внутрикомплексных соединений с различными органическими реагентами; например, железо определяют в виде соединений с сульфосалициловой кислотой HO3SC6H3(OH)COOH: фиолетового моносульфосалицилата в кислой среде (рН 1,82,5) или жёлтого трисульфосалицилата в щелочной среде (рН 911,5). В спектрофотометрии проводят сравнение светового потока, прошедшего через кювету с раствором анализируемым раствором, и светового потока, прошедшего через аналогичную кювету с чистым растворителем; по этим данным прибор рассчитывает величину оптической плотности или пропускания. Качественное определение вещества проводят по характеристической длине волны, количественное прямым способом по градуировочному графику (рис. 27а) или дифференциальным способом, точность которого не уступает обычному методу или даже выше. Дифференциальный способ заключается в том, что в качестве раствора сравнения («нулевого раствора») используется не чистый растворитель, а раствор с несколько меньшей концентрацией определяемого элемента, чем анализируемый. По отношению к нему проводят измерения оптической плотности всей серии растворов. При этом некоторые значения оптической плотности будут отрицательными (рис. 27б). Однако приборы обычно не приспособлены для измерения отрицательных значений D, поэтому в таких случаях измеряют оптическую плотность «нулевого раствора» по отношению к эталонному раствору и берут её значение со знаком минус. По полученным данным строят градуировочный график в координатах DC, используя как положительный, так и отрицательный участки, измеряют оптическую плотность анализируемого раствора по отношению к «нулевому» и определяют его концентрацию по градуировочному графику. Спектрофотометрический анализ широко используется в различных аналитических лабораториях. Он характеризуется погрешностью 1-2% и чувствительностью до 105 моль/л или 107%. Рис. 27. Определение концентрации анализируемого вещества по градуировочному графику: а) прямым способом, б) дифференциальным способом. Группировки, вызывающие избирательное поглощение электромагнитного колебания в видимой и ультрафиолетовой частях спектра, называются хромофорами. Основными хромофорами, дающими максимум поглощения в области 200-800 нм, являются системы сопряжённых двойных связей. Сопряжённые двойные связи поглощают кванты излучения с большей длиной волны, чем изолированные двойные связи. Для изолированных кратных связей в используемом для измерений интервале проявляется только переход карбонильной группы C = O (λmax = 270 нм). В ароматических системах переход электрона в возбуждённое состояние осуществляется также при меньшей затрате энергии, чем в случае изолированной двойной связи. Таким образом, основными хромофорами в УФ-спектроскопии являются сопряжённые C = C-связи, карбонильная группа C = O, системы C = C – C = O, ароматическое ядро. УФ-спектр органического вещества характеристичен, т. к. поглощение определяется только собственно хромофором и егоближайшим окружением, т. е. один и тот же хромофор проявляется практически одинаково как в исключительно простых, так и в самых сложных молекулах. В зависимости от непосредственного окружения одной итой же хромофорной группировки положение максимума поглощения в УФ-спектрах различных соединений может несколько меняться. Введение в молекулу различных заместителей или изменение внешних условий, например растворителя, обычно вызывает сдвиг полосы поглощения. Сдвиг максимума в сторону более длинных волн принято называть батохромным сдвигом (обусловлен наличием атома галогена, гидрокси-, амино-, алкильных групп), а сдвиг в сторону более коротких волн гипсохромным (например, образование водородной связи с растворителем). УФ-спектр в большинстве случаев представляет собой кривую с одним пологим максимумом (рис. 28). Рис. 28.УФ-спектр циклопентадиена. Обычно УФ-спектр характеризуют длиной волны, при которой наблюдается максимум поглощения, и молярным коэффициентом ослабления в этом максимуме. Например, спектр циклопентадиена (рис. 28) может быть передан записью: λmax (в гексане) 240 нм (ε = 3400). УФ-спектр вещества может иметь несколько максимумов поглощения, каждый из которых соответствует различным типам электронных переходов. В этом случае при цифровой записи спектра перечисляются длины волн максимумов поглощения и в скобках приводятся значения “ε”, соответствующие данному максимуму. УФ-спектроскопия используется для количественного анализа веществ. Для этого записывают спектр поглощения анализируемого вещества при одной концентрации, выбирают максимум поглощения. Если в спектре имеется несколько полос, выбор обычно останавливается на наиболее интенсивной, так как работа в области максимума светопоглощения обеспечивает наиболее высокую чувствительность определения. Активно развивается и абсорбционная спектрофотометрия в инфракрасном свете. Образование инфракрасных спектров связано с энергией колебаний атомов молекул. Полосы поглощения индивидуальны для молекул данного вещества. Однако среди них можно выделить полосы поглощения, обусловленные колебаниями функциональных групп атомов; они присутствуют в спектрах всех веществ, содержащих такие группы и называются характеристическими полосами. Рис. 29.Построение калибровочной кривой (б) по спектрам поглощения (а). По этим полосам можно судить о качественном составе вещества. Для количественного определения используют двухлучевые инфракрасные спектрофотометры, в которых свет от источника направляется по двум каналам: через кювету с раствором анализируемого вещества и через кювету с растворителем. Прибор снабжен самописцем, который автоматически показывает зависимость поглощения или оптической плотности от длины волны. При работе в инфракрасной части спектра в качестве растворителей используют сероуглерод, четыреххлористый углерод, поскольку вода сильно поглощает ИК-лучи. Инфракрасные лучи сильно поглощаются анализируемыми веществами, поэтому кюветы для получения инфракрасных спектров имеют размер не более 0,1 мм; их изготавливают из галогенидов металлов, поскольку стекло, в том числе и кварцевое, сильно поглощает свет в этой области. Образцы твёрдых веществ, не растворимых в пригодных для ИК-спектроскопии растворителях, готовят в виде суспензий в вазелиновом масле или KВr. Сочетание высокой чувствительности, точности и быстродействия объясняет широкое распространение спектральных методов в биологии, экологии, химии, медицине и других областях знаний. Оптические методы позволяют получить сведения о строении и свойствах молекул и веществ в целом, они применяются для изучения состояния биообъектов и характера изменений этого состояния в биологических системах (процессы полимеризации, деградации, связывание с другими молекулами, образование и распад фермент-субстратных комплексов, первичные фотофизические, а также фото- и радиационно-химические процессы с участием неустойчивых лабильных продуктов радикальной природы и т.д.). жүктеу/скачать 1,06 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|