Высшее образование
жүктеу/скачать 5 Mb.
|
| Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей осуществляется особыми ферментами — рест- рикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужеродную ДНК. Все ферменты условно можно разделить на следующие группы:
используемые для получения фрагментов ДНК; синтезирующие фрагменты ДНК на матрице РНК; соединяющие фрагменты ДНК; позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК; применяемые для приготовления гибридизационных проб. Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает в ней специфическую последовательность из 4 —6 нуклеотидов. Соответствующие последовательности в геноме бактерий замаскированы метилированием остатков с помощью метилаз. Согласно номенклатуре, предложенной Х.Смитом и Д.Натансоном, название рестриктазы складывается из трех букв: первая обозначает родовое название, две последующие — первые буквы вида. Например, фермент из Е. coli обозначают как Есо или из Haemophilus influenzae — Hin и т.д. Типовая или штаммовая идентификация следует за родовидовой, например, EcoRI или Hindll и т.д. В настоящее время различные фирмы выпускают более 100 разнообразных ферментов, опознающих различные последовательности нуклеотидов. Для каждого конкретного фермента они различаются по длине, первичной структуре и способу разрыва молекулы ДНК. Подавляющее большинство ферментов разрывает только двуни- тевую ДНК с образованием серии Рис 5л участки узнавания Фрагментов, называемых рестрикци- дНК тремя реСтриктазами из онными (или рестриктами; с тупы- Haemophilus parainfluenzae МИ либо липкими концами (рис. 5.1). (Hpal); Escherichia coli (EcoRI)
5'—G—Т-Т-- 3'-C-A-A-|-T-T-G -5' Расщепление EcoRI А—А—Т-Т-С-3' 5-G-j- 3'—С—Т—Т—A—A--G— 5' Расщепление Hindlll •A—G—С—Т— Т— 3' 5'- А 3'~Т—Т—С—G—А+А—5' Расщепление Многие рестриктазы вносят разры- и Haemophilus influenzae вы в две цепи ДНК со смещением на (Hindlll) несколько нуклеотидов и образованием на концах фрагменте! коротких одноцепочечных участков. Они способны образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепо- чечным участком, полученным с помощью того же фермента (липкие концы). Липкие концы позволяют легко соединить два любы;, фрагмента ДНК в одно целое. Полученный фрагмент ДНК (любого происхождения) можно встроить в очищенную ДНК плазмиды или бактериального вируса. Сравнение размеров фрагментов ДНК после обработки соответствующего участка генома набором рестриктаз позволяет построить рестрикционную карту, отражающую расположение определенной последовательности нуклеотидов в данном участке Сравнением таких карт можно оценить степень гомологии межд\ отдельными генами (участками) без определения их нуклеотид ной последовательности. Рестрикционные карты важны для клонирования ДНК, решения эволюционных и филогенетических задач. Для успешного решения задач генетической инженерии оченж важно быстро секвенировать (определить последовательность нук| леотидов) любые очищенные фрагменты ДНК. В настоящее врем$ объем информации о последовательностях ДНК столь велик, чт<| для хранения и анализа данных о фрагментах, целых геномах не*» обходимы новые технологии и компьютерная техника. « 32 32 132 32 32 Рис. 5.2. Схема получения семейства меченных по 5'-концу фрагмен ДНК в результате расщепления по определенному нуклеотиду (А )В биотехнологии рекомбинантных ДНК обычно используют два различных метода секвенирования ДНК: химический и ферментативный. Оба метода чрезвычайно надежны, быстры в исполнении И результативны. Результаты секвенирования позволяют также на основе генетического кода определить аминокислотную последовательность белка в соответствии с нуклеотидной последовательностью в соответствующем гене. На рис. 5.2 представлена схема химического метода секвенирования ДНК Исходный фрагмент ДНК, меченный 32Р по 5'-концу, подвергается специфическому расщеплению по определенному нуклеотиду (например, А), в результате чего образуются радиоактивные фрагменты разной длины, которые разделяются по размерам при гель-электрофорезе, а радиоактивные из них выявляются с помощью радиоавтографии. Обычно химическая процедура расщепления ДНК выполняется одновременно для четырех одинаковых проб ДНК с использованием химических агентов, расщепляющих ДНК по отдельным нуклеотидам (Т, С, G и А). Полученные образцы подвергают электрофорезу на параллельных дорожках одного геля, и по его результатам можно определить нуклеотидную последовательность ДНК (рис. 5.3). жүктеу/скачать 5 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|