Высшее образование
жүктеу/скачать 5 Mb.
|
19b6c9a
- Бұл бет үшін навигация:
- . 5.5. КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ В РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНИЗМАХ
I
Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чу-4 жеродными генами часто называют гибридными (или химернымиi); плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинант-f ных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм: бактериальную, грибную, растительную или животнук? клетку. Трансформация предусматривает предварительную o6paf ботку клеток соединениями, обусловливающими проникновени| ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, I которой способны существовать только клетки, получившие вещ торную молекулу, например в среду с определенным антибий тиком. 1 120 Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией. Практически общий способ трансформации и трансфекции основан на том, что при обработке клеток бактерий СаС12 их мембрана становится проницаемой для ДНК. Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэтому среди бактерий, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказывается трансформированной. Отделение ее от общей массы осуществляется в процессе клонирования. Для клонирования бактериальную суспензию определенной концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри из расчета 5—10 бактерий на 1 см2 поверхности. Бактериальная клетка на поверхности агара начинает делиться с образованием в итоге маленькой колонии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника. Отбор бактерий-трансформантов можно продемонстрировать, используя плазмиду pBR322 (см. рис. 5.10), содержащую два гена устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Для отбора этих бактерий в агар добавляют антибиотик — или ампициллин, или тетрациклин в зависимости от того, какой из генов (Ыа или tet) остался интактным после введения чужеродной ДНК. На такой среде клоны образуют клетки только с плазмидами. Для отделения рекомбинантных бактерий часть материала каждого клона переносят на другую чашку Петри, содержащую антибиотик, ген устойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинан- тов. На этих чашках Петри дают клоны только те бактерии, которые содержат исходную плазмиду, а рекомбинантные бактерии их не образуют. Такая тщательная селекция клонов по устойчивости к антибиотику позволяет идентифицировать рекомбинантные клоны. При поиске рекомбинантных клонов успешно применяют метод авторадиографии. Рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы и по синтезируемому ими продукту. Но чаще приходится идентифицировать непосредственно нуклеотидную вставку с использованием методов гибридизации. С этой целью бактериальные колонии выращивают на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на чашку Петри с питательной средой. Далее приготовляют реплики: к фильтру с исходными колониями прижимают свежий нитроцел- люлозный фильтр, который затем переносят на чашку Петри с плотной питательной средой, где образуются колонии, идентич- Hbie первым. Затем фильтр-реплику подвергают щелочной обработке, при Эт0М клетки в колониях лизируют и денатурированная ДНК из клеток связывается с нитроцеллюлозой в том участке, где былс. расположена соответствующая колония. При радиоактивной ДНК или РНК (меченной 32Р или 125J) выдерживание фильтра в ра створе, содержащем радиоактивный полинуклеотид, приводит гибридизации с комплементарными последовательностями. В итоге те участки фильтра, в которых находились рекомбинантны клоны с требуемой вставкой, оказываются радиоактивными * идентифицируются радиоавтографически. 5.4. ЭКСПРЕССИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ Эффективность функционирования бактериальных генов не одинакова, что обусловливает вариабельность концентрации отдельных белков в зависимости от их функций. Такие вариаций белков, например у Е. coli, обусловлены системой контроля ген ной экспрессии, осуществляемой в основном на уровне транс крипции ДНК, и зависят от количества синтезируемой на данно» гене мРНК и активности фермента РНК-полимеразы. Порядок чередовании нуклеотидных последовательностей в промоторно! участке структурного гена определяет степень активности РНК- полимеразы и инициацию процесса транскрипции. Бактериаль ные гены, включенные в геном, как правило, экспрессируютс? достаточно легко, давая мРНК и белок в силу того, что в сиг нальных последовательностях, управляющих процессами транс крипции и трансляции у различных прокариотических органиЗ мов, много общих черт. Что касается экспрессии генов эукариот бактериях, то она происходит крайне редко, если не создаваТ специальные условия, поскольку регуляторные участки эукариот отличны от таковых у бактерий. Регуляторные (сигнальные) участк не узнаются бактериальными РНК-полимеразами, что привода к замедлению транскрипции. При клонировании геномной ДНГ<, эукариотической клетки экспрессия генов не происходит изч отсутствия у бактерий системы сплайсинга. Следовательно, д! экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот необх| димо, чтобы данные гены находились под контролем прокари^ тических регуляторных элементов. В связи с этим для осуществл ния экспрессии эукариотического гена соответствующая кДЙ (или синтетическая ДНК), содержащая кодирующую последов тельность, в составе векторной молекулы (например, плазмида присоединяется к регуляторным элементам бактери и - промотор оператору и рибосом-связывающему участку. Таким образом, в сконструированных промежуточных река бинантных ДНК эукариотический ген будет находиться под ко!§ ролем бактериальных регуляторных элементов. Целесообразй встраивать ген в подходящий вектор для экспрессии, который f содержит регуляторные элементы, способствующие активной экспрессии встроенного гена после введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку. Например, к таким эффективным регуляторным участкам принадлежит промотор гена р-лактамазы (ген устойчивости к ампициллину, входящий в состав плазмиды pBR322). Промотор гена Р-лактамазы нерегулируемый, а использование таких промоторов не всегда удобно, так как синтезированные белки в большом количестве могут блокировать рост бактерий. В связи с этим целесообразнее использовать регулируемые сильные промоторы, включить которые для синтеза чужеродного белка можно и в том случае, когда получена большая бактериальная масса. В частности, к числу регулируемых сильных промоторов следует отнести термочувствительный промотор pL, который ответствен за экспрессию нескольких генов бактериофага. Белок-ре- прессор, блокирующий данный промотор, активен при 31 "С, но неактивен при 38 "С, следовательно, при инкубировании бактерий при 31 °С чужеродный ген не экспрессируется и, наоборот, повышение температуры вызывает инактивацию репрессора и высокий уровень синтеза нужного белка. Последовательность оснований длиной 6 — 8 нуклеотидов, расположенная непосредственно перед инициирующим кодоном АУТ у Е. coli, определяет эффективность процесса трансляции. Эта последовательность представляет собой участок связывания мРНК с рибосомой, и его сдвиг в ту или иную сторону способен уменьшать эффективность трансляции мРНК. По имени исследователей, идентифицировавших этот участок, он был назван последовательностью Шайн-Дальгарно. Обычно эту последовательность включают в состав самого вектора вместе с инициирующим кодоном на нужном расстоянии. При экспрессии векторов такого типа образуется гибридный белок, в котором несколько N-концевых аминокислотных остатков происходят от источника регуляторных элементов и инициирующего кодона прокариотического гена. Такие гибридные белки часто более стабильны; обработка их химическим или ферментативным способом приводит к выделению эукариотической части белка. Суммарная активность экспрессируемого гена возрастает с ростом числа копий рекомбинантной ДНК в расчете на клетку. Используя многокопийные плазмиды, можно получить сверхсинтез нужных белковых продуктов. Получены температурно-чувствитель- ные мутантные плазмиды, способные накопить до 1 — 2 тыс. копий на клетку без нарушения жизненно важных функций бактерий. Обычно же используемые плазмидные векторы поддерживался в клетке в количестве 20 — 50 копий. Получение бактериальных штаммов-сверхпродуцентов плазмидных генов — одна из важнейших задач современной биотехнологии в экономическом, медицинском и социальном аспектах .5.5. КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ В РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНИЗМАХ В настоящее время разработаны системы клонирования в бг териях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих. Особ: интерес с экономической точки зрения представляют систе] клонирования генов в грамположительных бактериях, многие которых являются сверхпродуцентами важнейших химических < единений. Значительных успехов в биоиндустрии удалось досга с клетками Bacillus subtilis, стрептомицетами и Saccharomy cerevisiae. Векторы для клонирования в таких системах представляют < бой двойные репликоны, способные существовать ив Е. coli, ] той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой 1 лью создают гибридные векторы, содержащие репликон какс либо из плазмид Е. coli и требуемый репликон (из бактерий, дро жей и др.), и первоначально клонируют с последующим отбор требуемых генов в хорошо изученной системе. Затем выделены рекомбинантные плазмиды вводят в новый организм. Такие в< торы должны содержать ген (или гены), придающий клетке-хо: ину легко тестируемый признак. жүктеу/скачать 5 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|