Высшее образование
жүктеу/скачать 5 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Клонирование в дрожжах.
| В. subtilis — непатогенный почвенный микроорганизм. Клеи ная стенка бактерии имеет простую структуру, позволяющую с< ретировать многие белки в культуральную жидкость. В частное 20 различных видов бактерий синтезируют более 40 фермент© внеклеточной локализацией. В этих бациллах обнаружены плазь ды и фаги, генетика которых хорошо изучена. Клонирование а ществляется с помощью так называемых челночных векторов, ] торые способны реплицироваться в клетках нескольких хозяев: subtilis, Е. coli, Staphylococcus aureus. Векторы были получены кс бинацией in vitro фрагментов плазмид St. aureus, Е. coli и хро» сомных фрагментов В. subtilis. Полученные рекомбинантные iirrt мы несут признаки устойчивости к антибиотикам.
Стрептомицеты широко применяют в биотехнологии в ка1 стве продуцентов антибиотиков. Конструирование векторов ^ клонирования в них началось с выделения плазмиды Scp2 Streptomyces coelicolor. На основе этой плазмиды были сконстр] рованы векторы, придающие стрептомицетам устойчивость к J тибиотикам, например к метиленомицину А. Клонирование в дрожжах. Среди дрожжей наиболее полно и чен вид S. cerevisiae. У этого вида в гаплоидных клетках содержи 17 хромосом, в их составе идентифицировано несколько сой генов. Большинство штаммов дрожжей содержат автономно р| лицирующуюся кольцевую ДНК длиной 2 мкм. Плазмида Scp| cerevisiae содержит около 6300 пар оснований и имеет 50—г^ копий на клетку. Ее гибриды с плазмидами обычно и использу*| 124 } качестве векторов. Работа с дрожжами облегчается тем, что подобно бактериям они могут расти в жидкой среде и давать колонии на твердой среде, а такие имеют сравнительно короткое время регенерации (несколько часов) вследствие малого размера генома. Процедура выделения ДНК в клетки дрожжей довольно проста. Обычно целлюлозную клеточную стенку удаляют обработкой ферментами, получая так называемые сферопласты. Их инкубируют с ДНК в присутствии СаС12 и полиэтиленгликоля. Мембрана при этом становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая инкубация сферопластов в среде с агаром восстанавливает клеточную стенку. Селекция дрожжевых клонов, трансформированных реком- бинантными плазмидами, основана на применении в качестве клеток-хозяев определенных мутантов, не способных расти на среде, в которой отсутствует тот или иной питательный компонент. Векторная плазмида содержит гены, которые при попадании в клетку-хозяина придают ей этот недостающий признак. Трансформанты легко отбираются по их способности давать колонии на обедненной среде. Применяя приемы, аналогичные использовавшимся при клонировании в бактериях, удается достичь синтеза чужеродных белков в дрожжевых клетках. Эти клетки подобно В. subtilis секретируют большое количество белка во внеклеточную среду, что используется также для секреции чужеродных белков, например интерферона человека (с. 43). жүктеу/скачать 5 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|