Высшее образование
жүктеу/скачать 5 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- 5.7. ПОЛУЧЕНИЕ ИНСУЛИНА НА ОСНОВЕ МЕТОДОВ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ
- ЦАТТЦТАГ
| У трансгенных овец с генами ГР и РФ ГР, несмотря на повышенный уровень ГР, скорость роста не увеличивалась. Вместе с тем, по данным большинства исследователей, у трансгенных свиней наряду с повышением содержания белка наблюдалось двукратное уменьшение толщины шпика (7 — 8 мм у трансгенных против 18 —20 мм у контрольных животных); аналогичные показатели отмечены у трансгенных овец (25 — 30 % жира у контрольных животных против 5 —7% у трансгенных овец).
■J Рассматривается возможность уменьшения лактозы в моло^ путем создания животных, у которых присутствует специфически для молочной железы промотор, соединенный с геном фермеш Р-галактозидазы, катализирующей распад лактозы. Молоко таки животных, не содержащее лактозы, могут использовать люди, которых не синтезируется р-галактозидаза. Ведутся работы по ввс дению генных конструкций в организм трансгенных животньи вырабатывающих антитела, предотвращающие маститы. Другая важная задача — выведение трансгенных животныз устойчивых к заболеваниям. Потери в животноводстве, вызванны различными болезнями, достаточно велики, поэтому все бол« важное значение приобретает селекция животных по резистенч ности к болезням, вызываемых микроорганизмами, вирусам! паразитами и токсинами. Пока результаты селекции на устойч* вость животных к различным заболеваниям невелики, но обнад< живающи. В частности, созданы популяции крупного рогатого скот с примесью крови зебу, устойчивые к некоторым кровепараз! тарным заболеваниям. Установлено, что защитные механизмы < инфекционных заболеваний обусловлены либо препятствием btoj жению возбудителя, либо изменением рецепторов. Вторженй возбудителей, равно как и их размножению, препятствуют в о< новном иммунная система организма и экспрессия генов главш го комплекса гистосовместимости. Одним из примеров гена рез! стентности у мышей служит ген Мх. Этот ген, обнаруженный модифицированной форме у всех видов млекопитающих, выраб) тывает у Мх+-мышей иммунитет к вирусу гриппа А. Ген Мх+ бь выделен, клонирован и использован для получения трансгенщ свиней, экспрессирующих ген Мх на уровне РНК. Однако даннь о трансляции Мх-протеина, обусловливающего устойчиво^ трансгенных свиней к вирусу гриппа А, пока не получены. Веду ся исследования в целях получения трансгенных животных, рез! стентных к маститу за счет повышения содержания белка лакп ферина в тканях молочной железы. На культуре клеток из поч« трансгенных кроликов было показано, что клеточные линии, о держащие трансгенную антисмысловую РНК, имели резистен ность против аденовируса Н5 (Ad5) более высокую на 90 — 98? по сравнению с контрольными линиями клеток. Л.К.Эрнст пр демонстрировал также устойчивость трансгенных животных с t ном антисмысловой РНК к лейкозу крупного рогатого скота, заражению вирусом лейкоза. !Показана возможность конструирования системы внутриклетО ной иммунизации против инфекционных вирусов с участием М тационных форм эндогенных вирусных белков, защищающих; соответствующих вирусов. Так, получены трансгенные куры, устй| чивые к лейкозу, у которых в клетках присутствовал белок вир| ной оболочки. ■ ются, содержание их сравнительно дешево, что делает этих вотных хорошими продуцентами разнообразных белков с низкое стоимостью. В России группой ученых под руководством JI. К. Эрнс|, получены трансгенные овцы с геном химозина, в 1 л молока кс торых содержится 200 — 300 мг химозина — основного компонец, та для производства сыра. Стоимость его будет в несколько pft ниже продукта, получаемого традиционным способом из сычуга молочных телят и ягнят. Приведены данные, свидетельствующщ о высокой эффективности производства сыра с использование" химозина молока трансгенных овец. Так, из 3 л молока трансгер ной овцы можно получить достаточное количество химозина д/ производства 1 т сыра из коровьего молока. 5.7. ПОЛУЧЕНИЕ ИНСУЛИНА НА ОСНОВЕ МЕТОДОВ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ Инсулин — гормон поджелудочной железы, регулирующц| углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень caxj pa в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит.) одному из тяжелейших заболеваний — сахарному диабету, коте» рый как причина смерти стоит на третьем месте после сердечн'* сосудистых заболеваний и рака. Инсулин — небольшой глобуля| ный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состой щий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двум дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде одноцепс чечного предшественника — препроинсулина, содержащего koi, цевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-зве£ ный соединительный пептид (С-пептид). При удалении сигналг ного пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислот ных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены C-nei тидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при 3$ мыкании дисульфидных связей. После протеолитического отщег ления С-пептида образуется инсулин. Известно несколько форм сахарного диабета. Самая тяжел» форма, для лечения которой больному необходим инсулин (инс линзависимая форма заболевания), вызвана избирательной гиб лью клеток, синтезирующих этот гормон (клетки островков Ла| герганса в поджелудочной железе). Форма сахарного диабета, д» лечения которой инсулин не требуется, распространена чаще, ней удается справляться с помощью соответствующих диет и ре:> ма. Обычно поджелудочная железа крупного рогатого скота и свш- не используется в мясной и консервной промышленности и поста ляется в вагонах-рефрижераторах на фармацевтические предпрй тия, где проводят экстракцию гормона. Для получения 100 г кр! таллического инсулина необходимо 800—1000 кг исходного сырй Синтез обеих цепей и соединение их дисульфидными связями для получения инсулина были проведены в 1963 и 1965 гг. тремя коллективами исследователей в США, Китае и ФРГ. В 1980 г. датская компания «Ново индастри» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека путем замещения 30-го остатка аланина в цепи В на остаток треонина. Оба инсулина не различались по активности и времени действия. Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках Е. coli (рис. 5.11). Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к З'-концу гена фермента р-галактозидазы и вводился в векторную плазмиду (pBR322). Клетки Е. coli, трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента р-галактози- дазы и А или В пептида инсулина, присоединенного к ней через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пептид освобождается. Однако замыкание дисульфидных мостиков между образованными цепями инсулина происходило с трудом. В 1981 г. синтезирован ген-аналог проинсулина — мини-С-про- инсулин, в котором 35-звенный С-пептид был заменен на сегмент из шести аминокислот: арг-арг-гли-сер-лиз-арг и показана его экспрессия в Е. coli. В 1980 г. У.Гилберт с сотрудниками выделили мРНК инсулина из опухоли Р-клеток поджелудочной железы крысы и с помощью обратной транскриптазы получили с нее кДНК. Полученную кДНК встроили в плазмиду pBR322 Е. coli, в среднюю часть гена пенициллиназы. Рекомбинантная плазмида содержала информацию о структуре проинсулина. В результате трансляции мРНК в клетках синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина, который выщепляли из такого белка трипсином. В 1978 г. сотрудниками Института биоорганической химии под руководством акад. Ю. А. Овчинникова был осуществлен синтез двух структурных генов, кодирующих синтез нейропептидов: лейцин- энкефалина и брадикинина. Синтезированный ген лейцин-энкефа- лина имел два «липких» конца: 5- 3' Полученный синтетический ген был встроен вместе с фрагментом природной ДНК, содержащим промотор и проксимальную часть гена белка Р-галактозидазы кишечной палочки Е. coli, в плазмиду -Ген проинсулина СООН C ИИОЕ! жүктеу/скачать 5 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|