Высшее образование
жүктеу/скачать 5 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- 5.8. СИНТЕЗ СОМАТОТРОПИНА
- 5.9. ПОЛУЧЕНИЕ ИНТЕРФЕРОНОВ
- эоооооос
- 5.10. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ
| JcNBr
Проинсулин Ферментативное расщепление А-цепь Рис. 5.11. Схема синтеза инсулина вектор pBR322 и обработан смесью рестриктаз — EcoRI и BamHI Полученная рекомбинантная плазмида рЕк была трансформиро; вана в клетки Е. coli. В результате экспрессии встроенного ген бактерия начала продуцировать гибридный (химерный) белок, cqf держащий на N-конце участок Р-галактозидазы, а на С-конце последовательность нейропептида. С помощью бромциана химер ный белок расщепляли in vitro и получали активный лейцин-энк4 фалин. На рис. 5.12 представлены схема клонирования синтетиче| кого гена лейцин-энкефалина и его экспрессия в клетках кише<|| ной палочки. и Аналогичным путем был синтезирован соматостатин — гормон гипоталамуса (рис. 5.13). Молекула соматостатина состоит из 14 аминокислотных остатков. Соматостатин подавляет выделение инсулина и гормона роста человека. В Национальном медицинском центре «Хоуп» (Калифорния) был осуществлен химико-ферментативный синтез гена длиной в 42 нуклеотида, способного кодировать соматостатин. Участок ДНК, кодирующий гормон соматостатин, получен путем соединения тринуклеотидов. Из 52 н. п. синтетического гена 42 пары составляли структурный ген гормона, а остальные служили для присоединения синтетического гена к плазмиде pBR322, -3' ДАТТЦДТГТАТГГТГГЦТТТЦТГТАА ■ •• •• •••• ••• • •«« • •• ••
/V (р-галактозидаза) •он > \ Ч EcoRI EcoRI Плазмида Н г, ^ BamHI Vя Р / I 74 t Рис. 5.12. Схема синтеза гибридного и активного лейцин-энкефалин а и о <4 li. i f 83- X ж и—о I яа также к сегменту лактозного оперона (lac) из генома Е. coli или к (3-галактозидазному гену. Такую синтетическую чужеродную ДНК встраивали непосредственно за бактериальным геномом (или внутри его) после расщепления ДНК рестрикционными эндонуклеаза- ми с образованием в результате трансляции гибридного белка. Основные этапы генно-инженерного синтеза соматостатина показаны на рис. 5.14. Синтетический ген соматостатина был встроен в плазмиду pBR322 Е. coli вблизи конца гена, кодирующего фермент (3-галактозидазу. Между двумя генами был помещен кодон метионина. После выделения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку кишечная палочка стала синтезировать гибрид- 'зшшттштт отлстсшсттсАстттслс in VIVO г^г^г^г^г^г^гл Расщепление бромцианом Фрагмент Р-галактозидазы Активный соматостатин Рис. 5.14. Схема синтеза соматостатина в бактериальной систем е ный белок. Часть его (соматостатин) затем отщепляли от Р-галак-? тозидазы BrCN. Такой сложный способ получения гормона был необходим, так как соматостатин, синтезированный в виде свободных молекул, быстро деградирует под действием бактериальных протеаз. Первый синтез соматостатина генно-инженерным способом был осуществлен в 1977 г. Бойером. Выход гормона составил 10000 молекул на одну клетку. Из 100 г биомассы Е. coli, выращенной в ферментере объемом 8 л, удалось выделить 5 мг соматостатина, т.е. столько, сколько можно его выделить из 100 г овечьих мозгов. 5.8. СИНТЕЗ СОМАТОТРОПИНА Соматотропин (или гормон роста человека ГРЧ) секретирует- ся передней долей гипофиза. Впервые он был выделен и очищен в 1963 г. из гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию — гипофизарной карликовости (1 случай на 5000 человек). Гормон обладает видовой специфичностью. Обычно его получают из гипофиза трупов, но в недостаточном количестве. Гормона хватает лишь для лечения 1/3 случаев гипофизарной карликовости в развитых странах. Основные производители — Швеция, Италия, Швейцария и США. Молекула ГРЧ состоит из 191 аминокислотного остатка. Препарат из трупного материала представляет собой смесь из нескольких форм, из которых пять имеют 22 кДа, другие являются димерами, а остальные — фрагментами, образующимися при протеолизе. Это приводило к тому, что у 30 % больных, получавших препарат, против гормона вырабатывались антитела, сводившие на нет его биологическую активность. Принимая во внимание это обстоятельство, в настоящее время ГРЧ синтезируют методами генетической инженерии в специально сконструированных клетках бактерий. Будучи синтезированным в клетках Е. coli, ГРЧ содержит дополнительный остаток метионина на Н2ТЧ-конце молекулы. Биосинтез ГРЧ из 191 аминокислотного остатка был осуществлен в 1979 г. Д. Гедделем с сотрудниками. Сначала клонировали двунитевую кДНК; далее путем расщепления получали последовательность, кодирующую аминокислотный порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот, — с фен (—NH2) до лей (23), и синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от первой до двадцать третьей со стартовым ATG-кодоном в начале. Затем два фрагмента объединяли и подстраивали к паре lac-промоторов и участку связыва-i ния рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл( культуры, что составляет 100 000 молекул гормона на клетку; Полученный гормон на конце полипептидной цепи содержал дополнительный остаток метионина и обладал значительной биологической активностью. С 1984 г. после серьезных клинических испытаний на токсичность компанией «Генетек» (Сан-Франциско) было начато широкомасштабное производство бактериального со- матотропина. ГРЧ в клетках Е. coli и в культуре клеток животных был получен в 1982 г. одновременно в Институте Пастера (Париж) и в Институте молекулярной биологии (Москва). Оказалось, что в бактериальных клетках возможен синтез аналогов ГРЧ, с помощью которых изучались участки молекулы, важные для стимулирования роста и процесса неоглюкогенеза на молекулярном уровне. Огромный интерес представляют выделение и синтез полипептида, обладающего полной биологической активностью гипо- таламического рилизинг-фактора соматотропина (СТГ-РФ). Введение этого фактора способно компенсировать недостаток соматотропина. Таким образом, наличие СТГ-РФ и самого гормона, полученных в генетически сконструированных бактериальных клетках, очень важно для успешного лечения заболеваний, обусловленных недостатком этого гормона, и ряда патологических заболеваний, таких, как некоторые формы диабета, регенерация тканей после ожогов и др. Предполагаем, что СТГ-РФ можно использовать и для увеличения массы и роста домашних животных, так как он, не обладая видовой специфичностью, способен стимулировать освобождение гормона роста у ряда животных. Р-Эндорфин — опиат мозга, состоящий из 31 аминокислотного остатка, был синтезирован в генетически сконструированных клетках в 1980 г. группой ученых из Австралии и США. Р-Эндорфин получен в клетках Е. coli в виде гибридного белка с Р-галактози- дазой. Процедура синтеза Р-эндорфина включала: получение путем обратной транскрипции мРНК — кДНК, кодирующей белок- предшественник, содержащий помимо последовательности Р-эн- дорфина последовательность АКТГ и p-липотропина (Р-ЛТГ), в дальнейшем удаляемые. p-Эндорфин, полученный из гибридного белка и тщательно очищенный, обладал значительной биологической активностью. Он специфически взаимодействовал с антисывороткой против Р-эндорфина. От p-эндорфина человека генно-инженерный p-эндорфин отличался по двум аминокислотам, и эти отличия можно было легко устранить на нуклеотидном уровне путем замены двух кодонов в ДНК бактериальной плазмиды. 5.9. ПОЛУЧЕНИЕ ИНТЕРФЕРОНОВ Интерфероны были открыты в 1957 г. в Национальном институте медицинских исследований в Лондоне как факторы устойчивости к вирусной инфекции. Было установлено, что клетки животных, подвергнутые воздействию вируса, выделяют в среду фактор, способный придавать свежим клеткам устойчивость к вирусной инфекции: он как бы препятствовал (интерферировал) размножению вирусов в клетке и в силу этой способности был назван интерфероном. Известны три группы интерферонов: а-интерфероны (а-И), образующиеся при воздействии вирусов на лейкоциты; Р-интер- фероны (Р-И), появляющиеся при воздействии вирусов на фибро- бласты; у-интерфероны, продуцируемые Т-лимфоцитами в ответ на воздействие бактериальными и вирусными антигенами или антисыворотками против поверхностных детерминант лимфоцитов. Все интерфероны (кроме а-И) гликопротеины; они представляют собой типичные глобулярные белки, причем на долю а-спи- ральных структур приходится от 40 до 75 %. В а-И обнаружены две дисульфидные связи. Интерфероны — низкомолекулярные белки из 146—166 аминокислотных остатков; видоспецифичны. К числу наиболее хорошо исследованных интерферонов человека следует отнести а-интерфероны; число генов, их кодирующих, примерно 20. у-Интерферон в отличие от гетерогенного класса а- интерферонов представлен всего одним индивидуальным белком, который кодируется одним геном. Менее ясна ситуация в отношении Р-интерферонов. Выделен только один белок, соответствующий Р-интерферону человека, — интерферон р,; ему соответствует практически вся противовирусная активность, обнаруживаемая после индукции фибробластов. Не исключено, что в геноме существует ряд генов, кодирующих различные Р-интерфероны. Интерфероны — это как бы первая линия обороны против инфекции. Интерфероны широко используются для лечения различных тяжелых заболеваний — острого вирусного гепатита, рассеянного склероза, остеосаркомы, миеломы и некоторых видов лимфом. Их применяют и для лечения меланом, ряда опухолей гортани, легких и мозга. С учетом видоспецифичности интерферонов, предназначенных для лечения, необходимы такие препараты, которые получены из клеток человека. Традиционно их извлекают из крови человека (из 1 л крови можно выделить всего 1 мкг интерферона, т. е. примерно одну дозу для инъекции). Долгое время большая часть мирового производства интерферонов осуществлялась в Финляндии (Хельсинки), а позже — во Франции. С 1980 г. одна из японских компаний наладила производство лимфобластоидного интерферона из лимфобластоидных клеток. С этой целью культура данных клеток индуцировалась вирусом сендай, после чего интерферон выделяли с помощью хроматографических колонок, заполненных моно- клональными антителами против получаемого интерферона. В Швеции лимфобласты выращивали в ферментерах объемом 2000 л; полученные интерфероны очищали с помощью моноклональных антител. Из всех видов интерферонов для мирового производства наиболее пригоден (3-И. Фибробласты, получаемые из тканей плода, можно поддерживать в культуре клеток, что дает возможность массового производства. Метод получения 3-интерферона был разработан в Англии. В целом вышеперечисленные методы получения интерферонов характеризуются низким выходом, высокой стоимостью и недостаточной чистотой препарата. На современном этапе наиболее перспективный метод — биосинтез интерферонов с помощью генетически сконструированных микроорганизмов. Однако использование генно-инженерных технологий для получения интерферонов человека сопряжено с рядом трудностей. Во-первых, в смеси мРНК, кодирующих различные белки, содержание кодирующих интерферон чрезвычайно мало — всего около 0,1%. Тем не менее кДНК, полученные обратным транскрибированием, были клонированы в Е. coli, что явилось революционным событием в теоретических и прикладных исследованиях интерферонов. Ген интерферона был встроен в векторную ДНК, и к нему были присоединены бактериальные регуляторные элементы, программирующие его транскрипцию и трансляцию в бактериальной клетке (рис. 5.15). Установлено, что интерфероны синтезируются в клетке сначала в виде предшественников, содержащих на N-конце полипептидной цепи сигнальный пептид, который затем отщепляется, и в результате образуется зрелый интерферон, обладающий полной биологической активностью. Бактерии не содержат ферментов, Точка инициации Рис. 5.15. Схема рекомбинантной плазмиды, обусловливающей синтез интерферона человека в Е. coli способных отщепить сигнальный пептид с образованием зрелого белка. Поэтому для того чтобы бактерии синтезировали зрелый интерферон, следует ввести в плазмиду только ту часть гена, которая его кодирует, и удалить часть гена, кодирующую сигнальный пептид. Данная процедура осуществлялась следующим образом. Геь интерферона содержит три участка расщепления рестриктазой Sau ЗА1, из которых один находится рядом с сигнальной частью. Неполное расщепление гена этим ферментом позволяет выделить фрагмент гена, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый интерферон, но без первого цистеина. Триплет ATG, кодирующий цистеин, отщепляется ферментом вместе с сигнальной частью. Для восстановления полинуклеотидной последовательности полного гена химически был синтезирован небольшой фрагмент ДНК, содержащий данный триплет, а также примыкающий к нему триплет ATG — точка инициации синтеза белка. Этот фрагмент присоединили к изолированной части зрелого гена, и в результате был восстановлен полный ген зрелого интерферона. Реконструированный ген ввели в плазмиду таким образом, что с ним оказался рядом участок ДНК-промотор, обес» печивающий начало синтеза мРНК. Экстракты из Е. coli, содержащие такую плазмиду, обладали противовирусной активностью. Синтезированный генно-инженерным способом интерферон был выделен, очищен, и его физико-химические свойства оказались близкими свойствам интерферона, полученного из крови, доноров. Удалось получить бактерии, способные синтезировать до 5 мг интерферона на 1 л бактериальной суспензии, содержащей примерно 10й бактериальных клеток, что в 5000 раз превосходит то количество интерферона, которое можно извлечь из 1 л крови доноров. При использовании генно-инженерных технологий в разных лабораториях были получены штаммы бактерий, продуцирующих различные интерфероны: а-, (3- и у-типов. Недостаток использования Е. coli для получения [3- и у-интерферонов — отсутствие В бактерии аппарата гликозилирования эукариотических белков, что приводит к синтезу негликозилированных молекул. И хотя роль' гликозилирования неясна и негликозилированные р- и у-интер- фероны практически полностью сохраняют противовирусную активность, эта особенность диктует осторожный подход к использованию генно-инженерных препаратов в медицинской практике. В настоящее время гены интерферонов клонированы в дрожжИ| и клетки высших эукариот, способных осуществлять гликозили- рование. В 1981 г. в США впервые для синтеза лейкоцитарного интерфе-" рона человека были употреблены генетически сконструированные клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Полученная эффек; тивная экспрессия гена LeIF и замена бактерий клетками дрож жей позволили увеличить производство интерферона в 10 раз. > Большое количество исследований было посвящено химическому синтезу гена, кодирующего ЛИЧ из 166 аминокислот. Соответственно, данный ген из 514 н.п. оказался самым крупным геном, синтезированным в 1982 г. группой английских ученых. В России в 1984 г. был осуществлен полный синтез гена а-И размером Интерферон ♦ Мембранный рецептор | Мессенджер эоооооос
Протеинкиназа 1 Клеточный геном Индукция ^ синтеза ферментов к», .»•.'» •«., i / Л Двухцепочечная РН К Ингибирование синтеза белка Активация РНКазы I, деградация иРНК и рРНК Рис. 5.16. Механизм действия интерферон апримерно 600 н.п. (Институт биоорганической химии под руксй| водством М. Н. Колосова). Несмотря на успехи, достигнутые в области получения интерн феронов с помощью генно-инженерных технологий и их приме-*, нения для лечения различных вирусных заболеваний, в том числе? онкологических, предстоит еще решить многие вопросы. На co-f временном этапе не все гены интерферонов идентифицированы: обнаружены новые гены aL; мало известно о генах фибробластно-; го интерферона (кроме гена Pi); до конца не расшифрованы механизмы их биосинтеза и взаимодействия с другими веществами. Выяснение многих явлений, связанных с интерферонами, приведет; к созданию новых средств для лечения ряда тяжелых заболеваний. Схема биологического действия интерферона представлена на рис. 5.16. ;> Механизм действия интерферона можно свести к следующим? основным этапам. Связываясь с клеточными рецепторами, интер-, фероны инициируют синтез двух ферментов: 2',5'-олигоаденилат- синтетазы и протеинкиназы за счет инициации транскрипции соответствующих генов. Оба фермента проявляют свою активность в присутствии двухцепочечных ДНК, являющихся продуктами репликации многих вирусов или содержащихся в их вирионах. Фер~, мент 2',5'-олигоаденилатсинтетаза катализирует синтез 2',5'-олиго-; аденилатов (из АТР), которые активируют клеточную рибонуклеа- зу I; протеинкиназа фосфорилирует (и тем самым активирует) фактор инициации трансляции IF2. В результате этих событий ингиби-> руются биосинтез белка и размножение вируса (деградация иРНК. и рРНК) в инфицированной клетке, что вызывает ее лизис. Вероятны и другие механизмы действия интерферонов, например, инактивация тРНК, нарушение процессов метилирования и др. . 5.10. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ жүктеу/скачать 5 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|