Высшее образование
Состав питательных сред, применяемых при культивировании клеток и тканей
жүктеу/скачать 5 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- NH4NO3
- 6.3. ДВДИФФЕРЕНЦИРОВКА КАК ОСНОВА I КАЛЛУСОГЕНЕЗА |
- 6.4. ТИПЫ КУЛЬТУР КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
- 6.5. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАЛЛУСНЫХ КЛЕТОК
го синтеза. В качестве источника света используют люминесцентные лампы. Для большинства травянистых растений оптимум освещенности составляет примерно 1000 люкс. Слишком низкая (300 люкс) или высокая (3000—10 000 люкс) освещенность подавляет рост. Освещение может влиять на метаболизм каллусных клеток. Так, в культурах чайного растения под действием света увеличивался биосинтез полифенолов. Напротив, в культуре клеток Scopolia parvi- flora свет подавлял образование алкалоидов. Кроме интенсивности освещенности на культуру ткани и ее физиологические особенности влияет качество света. Так, более 20 флавонов и флавоноловьп гликозидов образуется в культурах клеток петрушки после освещения ее непрерывным люминесцентным светом «холодный белый» Вместе с тем синтез флавоновых гликозидов активируется при последовательном облучении ультрафиолетовым светом, а затем светом, лежащим в области «красный—длинноволновый красный* Температура. Для большинства каллусных культур оптимальна температура 26 °С. В то же время каллусы и культуры клеток диос кореи дельтовидной хорошо растут даже при температуре 32 °С. Б отличие от роста культур клеток и тканей индукция их морфогенеза требует более низких температур (18 — 20 °С). Влияние температуры на метаболизм клеток in vitro изучено слабо. Есть данные, что в каллусных культурах максимальное образование алкалоидов наблюдалось при температуре 25 °С, а при повышении температуры резко снижалось. В суспензионных культурах клеток Ipomoea содержание жирных кислот значительно увеличивалось, если их выращивали при субоптимальных температурах роста (15 °С) Поэтому при выращивании культуры in vitro необходимо тщательно изучать влияние всех абиотических факторов, в том числе температурного, на рост и метаболизм клеток. Аэрация. Для выращивания суспензионных культур большое значение имеет аэрация. Особенно важно снабжение воздухом культивируемых клеток в больших объемах ферментеров. При сравнении разных типов ферментеров было показано, что синтез вторичных метаболитов в суспензионной культуре был наибольшим при подаче воздуха снизу. При выращивании клеток в малых объемах (в колбах) нормальная аэрация достигается при постоянном перемешивании суспензии. Влажность. Оптимальная влажность в помещении, где расту!, культуры, должна составлять 60 — 70%. Таким образом, культивирование клеток и тканей зависит от многих факторов внешней среды, и действие их не всегда хорошо изве? стно. Поэтому при введении в культуру нового вида растений необ-т ходимо прежде всего тщательно изучить влияние физических фак торов на рост и физиологические характеристики этой культуры. 6.3. ДВДИФФЕРЕНЦИРОВКА КАК ОСНОВА I КАЛЛУСОГЕНЕЗА | Культура изолированных тканей обычно представлена каллус ными и гораздо реже опухолевыми тканями. Каллусная ткань об разуется в результате повреждения на целых растениях, а также J стерильной культуре на эксплантах — фрагментах ткани или орга на, используемых для получения первичного каллуса. Возникновение каллуса связано с неорганизованным делением (пролиферацией) дедифференцированных клеток. Дедифференцировка — основа создания каллусной ткани. В процессе дифференцировки клетки теряют способность делиться. Дедифференцировка — это возвращение клеток в меристематическое состояние, при котором они сохраняют способность к делению. У интактных растений дедифференцировка и индукция каллусогенеза возникают вследствие образования раневых гормонов (травматиновая кислота) при механическом повреждении. Обязательное условие дедифферен- цировки тканей экспланта и превращения их в каллусные клетки, помимо повреждения, — присутствие ауксинов и цитокининов. Среди ауксинов чаще всего используют 2,4-D (2,4-дихлорфенок- сиуксусную кислоту), ИУК (индолил-3-уксусную кислоту), НУК (а-нафтилуксусную кислоту), причем наибольшую активность проявляет 2,4-D. Из цитокининов в искусственные питательные среды обычно вносят кинетин, 6-БАП (6-бензиламинопурин), зеатин. Наиболее активны 6-БАП и зеатин. Функции этих двух групп гормонов в каллусогенезе разные, но они тесно связаны между собой. Ауксины вызывают процессы дедифференцировки клетки, подготавливают ее к делению. Затем цитокинины инициируют деление клеток. Последние исследования свидетельствуют, что ауксины индуцируют синтез главной протеинкиназы клеточного деления P34cdc2, а цитокинины — циклинов. Таким образом, действие этих гормонов проявляется только при последовательном или одновременном внесении их в среду. Кроме того, оно будет зависеть от физиологического состояния клеток экспланта, от их компетентности к действию тех или иных внешних факторов. Результаты исследований показали, что полисахариды и какие-то неизвестные индукторы тоже могут вызывать деление клеток, приводящее к образованию каллуса. Во время процесса дедифференциации, который у всех клеток сходен, клетки должны утратить характерные черты исходной ткани. В первую очередь они теряют запасные вещества — крахмал, белки, липиды. В них разрушаются специализированные клеточные органеллы, в частности хлоропласты, но возрастает число ами- лопластов. Кроме того, разрушается аппарат Гольджи, перестраиваются эндоплазматический ретикулюм и элементы цитоскелета. Через несколько часов после перенесения экспланта в условия in vitro начинается новый синтез белка. Он связан, вероятно, с механическим повреждением и действием гормонов, сохранившихся в экспланте с момента его изоляции из растения. Когда данные гормоны израсходуются, синтез белка прекращается. Если в это время клетки будут культивироваться на питательной среде, содержащей ауксины и цитокинины, то начнется каллусогенез, т.е. в результате дедифференцировки и деления клеток будет образовываться первичный каллус. Таким образом, специализированная клетка растительной ткани становится каллусной в результате дедифференцировки, т.е. восстановления у нее способности к делению. 6.4. ТИПЫ КУЛЬТУР КЛЕТОК И ТКАНЕЙ В зависимости от способа, условий культивирования и происхождения можно выделить несколько типов культур клеток и тканей. Если культивирование происходит поверхностно на агаризо- ванной питательной среде, то образуется каллусная ткань. Она не имеет четко выраженной структуры, но может различаться по плотности. Происхождение и условия выращивания определят, будет ли каллусная ткань рыхлой, средней плотности или плотной. Рыхлая каллусная ткань имеет сильно оводненные клетки, легко распадается на небольшие группы клеток и кластеры и поэтому может быть использована для получения суспензионной культуры. Ткань средней плотности характеризуется хорошо выраженными меристематическими очагами. В ней легко инициируются процессы органогенеза. Наконец, у плотных каллусных тканей различают зоны редуцированного камбия и трахеидоподобных элементов:
сильно обводненные, легко распадающиеся на отдельные клетки (получение суспензии) Существует также суспензионная культура клеток, которую выращивают в жидкой питательной среде, так называемое глубинное культивирование. Клеточные суспензии образуются как из каллусных тканей, так и непосредственно из экспланта. Для получения суспензионных культур предпочтительнее брать каллусы рыхлого типа. Если для этой цели необходимо использовать плотный каллус, то его можно разрыхлить, исключив из питательной среды соли Са2+. С этой же целью можно культивировать ткань на среде, содержащей ауксин 2,4-D или ферменты — пектиназу (0,2 мг/л) и целлюлазу (0,01 мг/л). Наилучший эффект достигается при добавлении ферментов. Суспензионные культуры клеток можно получить и непосредственно из экспланта по методу Ф. Стюарда. Для этого эксплант помещают в жидкую среду при постоянном автоматическом перемешивании. Дедифферениированные клетки отрываются от экспланта, образуя суспензию в питательной среде. Постоянное встряхивание — необходимое условие культивирования клеточных суспензий. Суспензионные клетки делятся в присутствии тех же двух групп гормонов (ауксинов и цитокининов), которые индуцируют деление клеток в каллусных тканях. Следовательно, можно сказать, что суспензионные культуры представлены разными агрегатами каллусных клеток. Клеточные суспензии играют значительную роль в биотехнологии. Они могут быть использованы для получения изолированных протопластов, которые применяют для клеточной селекции, при введении чужеродных ДНК и других процессах. Клеточные суспензии культивируют в больших количествах для получения вторичных метаболитов, выявления новых веществ, для выращивания клеточной биомассы. Однако увеличение клеточной биомассы в результате деления клеток и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Поэтому необходимо хорошо знать физиологию, свойства клеток в суспензионных культурах, чтобы получить максимальный выход продукта. Состояние клеточных суспензий характеризуется плотностью клеточной популяции. За 14 —16 дней (средняя длительность пассажа) плотность обычно повышается от 5-104 до 5-106 кл/мл. Качество суспензии определяется степенью агрегированное™. Агрегаты должны содержать не более 10 — 12 клеток. Большой интерес представляет культура одиночных клеток. Ее применяют в клеточной селекции для отбора гибридных клеток и их клонирования, а также для генетических и физиологических исследований. Например, вопрос о причинах генетической неоднородности легче решать, используя клон-потомство одной клетки, а не гетерогенную ткань исходного экспланта. Однако культивирование одной или нескольких клеток связано с определенными трудностями, состоящими в том, что одиночная клетка живет, но не делится в тех условиях, которые разработаны для нормального роста и размножения клеток каллус - ной ткани. Поэтому при культивировании одиночных клеток потребовалась выработка специальных методов. Все они основаны на использовании так называемого «кондиционирующего фактора» — метаболитов, выделяемых в среду делящимися клетками. Когда на питательную среду высаживается одна клетка или небольшое их количество, они не делятся, так как выделяемого кондиционирующего фактора не хватает для индукции деления. Следовательно, необходимо повысить концентрацию фактора в питательной среде. Этой цели служат следующие методы : Метод ткани-«няньки» — кондиционирующий фактор выделяется находящимися рядом с одиночной клеткой кусочками тка- ни-«няньки» (рис. 6.1). Метод «кормящего слоя» — кондиционирующий фактор выделяют активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений, что и одиночная клетка (рис. 6.2). Кондиционирование среды — осуществляется путем добавления в нее питательной среды, отфильтрованной от интенсивно делящихся клеток. Метод культивирования одиночных клеток — осуществляется в микрокапле, т.е. в очень малом объеме (=20 мкл) богатой питательной среды (Ю.Ю.Глеба). 2 1 Рис. 6.1. Выращивание отдельных клеток с помощью ткани-«няньки» (по Р. Г. Бу- тенко, 1999): 1 — одиночные клетки; 2 — каллусная куль- тура-«нянька» Точно сказать, что представляет собой кондиционирующий фактор, пока невозможно. Согласно исследованиям А.И.Павловой и Р. Г. Бутенко (1969), этот фактор водорастворим, термостабилен, не заменяется фитогормонами, включает низкомолекулярные вещества. Химическая природа кондиционирующего фактора доказывается с помощью довольно простого эксперимента. Если 4 -2 Рис. 6.2. Использование культуры сус- _ j пензионных клеток в качестве «кор* 5 ных клеток кукурузы (By Дык Куанг^ 3. Б. Шамина, 1985): / — колонии клеток; 2 — фильтровал ная бумага; 3 — алюминиевая сетка; 4 пенополиуретан; 5 — суспензия клет мящего слоя» для выращивания изо-i лированных протопластов и одиноч-* Рис. 6.3. Доказательство химической природы фактора кондиционирования: / — одиночные клетки; 2 — ткань-«нянька»; 3 — делящиеся клетки; 4 — целлофан; 5— стеклянные пластинки разделить одиночные клетки и ткань-«няньку» стеклянной пластиной, то деления клеток не наступает. Если вместо пластин поместить целлофан, то хотя и с задержкой начинается деление одиночных клеток (рис. 6.3). 6.5. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАЛЛУСНЫХ КЛЕТОК Каллусная клетка имеет свой цикл развития, аналогичный циклу всех других клеток: деление, растяжение, дифференциров- ку, старение и отмирание. Дифференцировку каллусных клеток принято называть вторичной. Однако ее не следует путать с вторичной дифференцировкой, на которой основан морфогенез. Рост каллусных тканей подчиняется общим закономерностям. Кривая роста каллусных тканей также имеет характер ^-образной кривой (ростовая кривая Сакса) и включает пять фаз, длительность которых неодинакова у разных видов растений (рис. 6.4).Первая фаза — латентная, или лаг-фаза, заключается в подготовке клеток к делениям. Вторая — фаза экспоненциального роста (логарифмическая). В это время митотическая активность наибольшая, рост идет с ускорением, масса каллуса увеличивается. Третья фаза — линейная, характеризуется постоянной скоростью роста каллусной массы. Четвертая — фаза замедленного роста, во время которой интенсивность деления клеток резко снижается. Во время пятой фазы — стационарной — масса каллуса не увеличивается, так как начавшееся отмирание клеток еще компенсируется за счет их деления. Далее следует отмирание каллуса. Культивируемые каллусные клетки и ткани сохраняют многие физиологические особенности, свойственные клеткам растения, из которого они были получены. Сохраняются, например, такие свойства, как морозостойкость, устойчивость к абиотическим факторам (температура, засоление, фотопериодическая реакция), а главное, хотя и в разной степени, способность к синтезу вторичных метаболитов. Наряду с общими у каллусных клеток появляются свои, характерные только для них особенности. Например, длительно культивируемые in vitro клетки высших растений, как каллусные, так и суспензионные, образуют специфическую популяцию, относящуюся к типу неполовых, — популяцию соматических клеток. Наиболее характерные свойства этой популяции — физиологическая асин- хронность и генетическая гетерогенность. Физиологическая асинхронностъ — наиболее важное свойство не-: половой популяции. Оно заключается в том, что в каждый дан-! ный момент времени клетки находятся в разных фазах роста: однц делятся, другие растут, а третьи уже стареют. Поэтому общее физиологическое состояние такой популяции принято оценивать по состоянию большинства клеток. ) Причины возникающей асинхронности весьма разнообразны!? | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||