Вопросы для ветеринарных специалистов лабораторий ргп «рвл» Бруцеллез, инфекционный эпидидимит и методы их диагностики?Бруцеллёз
жүктеу/скачать 434 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- 190. Термостабильная ДНК-полимераза
- 191. Этапы проведения ПЦР.
| 189.Что такое праймеры в ПЦР.Праймеры - это короткие, длиной 20-30 оснований, одноцепочечные ДНК (дезоксиолигонуклеотиды), комплиментарные 3-концам цепей копируемой ДНК- матрицы, благодаря которым ограничивается фрагмент ДНК, который будет миллионы раз скопирован ферментом Taq-ДНК - полимеразой, присоединяющейся к 3-концам праймеров и достраивающей их до заданной длины в несколько сот или тысяч пар оснований. Поскольку праймеры каждый раз встраивается в амплифицируемые фрагменты ДНК- матрицы (амплификоны), то они в реакционной смеси ПЦР присутствуют в избытке: концентрация их составляет 0,5 - 1,0 мкМ. Специфичность получаемого продукта ПЦР в значительной степени определяется так называемой температурой отжига праймеров, при которой
взаимодействуют с комплиментарными участками ДНК- матрицы, образуя даухцепочечные структуры. Температура отжига определяется длиной праймера и содержанием ГЦ-пар. 190. Термостабильная ДНК-полимераза. В реакции используются термостабильные ДНК-полимеразы, выдерживающие высокую температуру на всех этапах цикла ПЦР в течение нескольких десятков циклов. Количество коммерчески доступных термостабильных ДНК-полимераз, отличающихся некоторыми своими свойствами, достаточно велико. Наиболее часто используется Taq-полимераза, первоначально выделенная из термофильного микроорганизма Thermus aquaticus. Другие полимеразы чаще применяются для особых приложений ПЦР. Современные коммерческие препараты термостабильных полимераз обеспечивают, как правило, стабильную воспроизводимую активность, что позволяет использовать технологию ПЦР в стандартной лабораторной практике. 191. Этапы проведения ПЦР. ПЦР-анализ состоит из нескольких этапов. Первый этап - пробоподготовка - заключается в обработке исследуемого материала (приготовление суспензии, центрифугирование). На втором этапе проводится выделение наследственного материала - ДНК или РНК - из клеток. При этом после лизиса клеток и разрушения комплекса «ДНК-белок» производится осаждение ДНК или РНК на сорбенте с последующим переходом их в элюирующий буфер. На третьем этапе проводится амплификация, то есть умножение количества специфических участков ДНК. Для этого используются тест-системы, в состав которых входят праймеры - олигонуклеотиды, которые являются специфическими для каждого возбудителя. К разлитой в микропробирки ПЦР-смеси добавляют образцы и контроли, которые помещают в амплификатор или термоциклер - программируемый термостат с высокой скоростью и точностью задаваемой температуры. Процесс амплификации заключает в себе три стадии: денатурация, отжиг и элонгация. При определении в клинических образцах РНК-содержащих вирусов амплификации предшествует стадия обратной транскрипции, при которой РНК переводят в форму ДНК с использованием фермента обратной транскриптазы, или ревертазы. Четвертый этап ПЦР-диагностики заключается в проведении электрофоретической детекции продуктов ПЦР - ампликонов. При этом продукты ПЦР помещают в лунки агарозного геля и подвергают действию постоянного электрического тока, в результате чего отрицательно заряженная молекула ДНК движется к положительному электроду. В состав геля входит бромид этидия, который, образуя устойчивый комплекс с ДНК, делает эти полосы хорошо заметными при просмотре под ультрафиолетовым облучением. жүктеу/скачать 434 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|