Вопросы для ветеринарных специалистов лабораторий ргп «рвл» Бруцеллез, инфекционный эпидидимит и методы их диагностики?Бруцеллёз
жүктеу/скачать 434 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- 188. Основные компоненты ПЦР
| 187. Что собой представляет ПЦР. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – искусственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro. Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом – ДНК-полимеразой, как и в клетках живых организмов. ДНК-полимераза, двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице), синтезирует комплементарную ей последовательность ДНК. Важно, что ДНК-полимераза не может начать синтез цепи ДНК "с нуля", ей необходима короткая "затравочная" цепь РНК или ДНК, к которой она может начать присоединять нуклеотиды.
188. Основные компоненты ПЦР1. Два синтетических олигонуклеотидных праймера (длиной примерно по 18-25 нуклеотидов). Каждый из них комплементарен одной из цепей двуцепочной матрицы, ограничивающей начало и конец амплифицируемого участка. Специфичность реакции в основном определяется температурой отжига праймеров, при которой происходит их комплементарное взаимодействие с ДНК-матрицей. Температура зависит от длины праймера и содержания G-C пар (G — гуанин, С — цитозин). Как правило, она варьируется в диапазоне 50-64° С. Дизайн праймеров осуществляется с использованием специальных компьютерных программ и автоматических ДНК-синтезаторов.2. Термостабильная ДНК-полимераза— фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woe-sei (Pwo-полимераза) и другие.3. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).4. Ионы Mg2+, необходимые для активации полимеразы.5. Буфер, создающий оптимальные условия для функционирования фермента. Как правило, используется Трис-HCI буфер, который удерживает рН реакционной среды в пределах 7,8. Для стабилизации фермента в среду добавляют желатин или бычий сывороточный альбумин, неионные детергенты (Твин-20, Тритон Х-100 и др.). жүктеу/скачать 434 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|