Высшее образование
Клонирование в клетках животных
жүктеу/скачать 5 Mb.
|
| Клонирование в клетках животных. Проблема введения генов в клетки млекопитающих очень важна для исследования функционирования генов высших эукариот.
Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных различными путями. Суть одного из них состоит в трансформации клеток требуемым геном, соединенным с одним из генов, для которых осуществляется селекция. Для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, был разработан метод, получивший название метода маркера. Примером может служить метод получения клеток, дефектных по синтезу фермента тимидинкиназы (ТК~-клетки). Такие клетки трансформировались фрагментами ДНК вируса герпеса (HSV), содержащего ген фермента ТК, и после трансформации они приобретали способность к синтезу фермента на селективной среде, т.е. становились ТК+-клетками. Клетки ТК+ легко отличаются от клеток ТК~, поскольку способны расти на средах с ами- ноптерином (ингибитор, блокирующий определенные стадии биосинтеза нуклеотидов), гипоксантином и тимидином. Следовательно, в данном случае для трансформации клеток животных были использованы гибриды бактериальных плазмид с геном ТК из вируса герпеса. Для этого предварительно проводили клонирование и идентификацию генов в клетках Е. coli и затем полученная рекомбинантная плазмида вводилась в ТК~-клетки. Анализ методом бдот-гибридизации подтвердил, что выжившие клетки содержали интегрированный в геном ТК-ген вируса герпеса. Селективные маркеры дают возможность вводить в клетки млекопитающих любой ген, заранее лигированный с клонированным селективным маркером. В последние годы сконструировано большое количество так называемых челночных векторов и их рекомбинантных производных, способных к репликации в животной и бактериальной клетках, экспрессирующие клонируемый ген в животной клетке. К числу таких векторов можно отнести векторы из плазмиды pBR322 и интактного района транскрипции ДНК SW-40. Геном SW-40 представляет собой циклическую ДНК длиной 5243 п.о. Однако в вирусах животных размеры несущественных областей малы и в них нельзя внедрить большие фрагменты чужеродной ДНК, например ген дигидрофолатредуктазы мыши размером 42 kb. В большинстве случаев чужеродная ДНК замещает существенные гены, в результате чего рекомбинантные вирусы утрачивают способность к репликации. Для ее функционирования используют «вирусы- помощники», синтезирующие продукты недостающих генов, за счет которых и существует рекомбинантный вирус. Обычно опухолевые вирусы (в том числе SV-40) внедряют свою ДНК в хромосому клетки-хозяина и тем самым убивают ее при своем размножении. Обычно вирус бычьей папилломы в трансформированных клетках существует в виде эписомы (=100 копий на клетку) и используется в качестве основы для конструирования эпи- сомных векторов. Одна из важнейших задач генной инженерии — разработка технологий по созданию векторов, подобных плазми- дам, не убивающим клетку-хозяина и эффективно экспрессирую- щим клонируемый ген в животной клетке. Представляют немаловажный интерес микроинъекции ДНК непосредственно в ядро клетки. Так, плазмиды, содержащие фрагмент вируса герпеса с геном тимидинкиназы, и плазмиды pBR322 были инъецированы в ТК-клетки, при этом ТК-ген проник в ядра и нормально в них реплицировался. Трансформация соматических клеток млекопитающих открывает возможность для изучения механизмов регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки животных, в том числе и человека. Культуры клеток млекопитающих могут быть эффективным источником выделения ряда вирусных антигенов с целью получения вакцин для животных и человека. В настоящее время разработаны способы введения генов в эмбриональные клетки млекопитающих, мух и некоторых растений с целью изменения свойств организма, таких, как скорость роста, устойчивость к заболеваниям и внешним воздействиям. Подобного рода работы были начаты с довольно крупными яйцами амфибий, а затем продолжены с яйцеклетками и эмбрионами мыши.(его чистоты, концентрации) во многом зависит эффективное!- получения трансгенных животных. Обычно гены транспортирую!, на ранних стадиях развития животного (в большинстве случаев на. стадии зиготы и двухклеточных эмбрионов). Для трансформаций- генов в геном животного используют следующие приемы: микроб инъекцию ДНК в пронуклеус зигот или в каждый бластомер ys? двухклеточного эмбриона; введение ДНК с помощью ретрови* русных векторов; получение трансгенных химер из генетически, трансформированных клеток и эмбрионов. В настоящее время наиболее распространенный метод — микроинъекция ДНК. Ее осу^ ществляют с помощью специальной пипетки (внутренний диаметр ее около 1 мкм), а количество инъецированного раствору ДНК составляет 1 — 2 пкл. После инъекции ДНК эмбрионы куль-; тивируют до момента пересадки реципиентам. Следует отметить^™ что микроинъекция эмбрионов сельскохозяйственных животный значительно сложнее, чем микроинъекция эмбрионов мышей i£ кроликов. * После небольшого культивирования in vitro проинъецирован4' ные эмбрионы переносят в яйцеводы (хирургическим путем) ре* ципиентов. Каждому реципиенту мыши, кролика и свиньи обь№ но пересаживают 20 — 30 инъецированных зигот, причем у свине$ все эмбрионы трансплантируют в один яйцевод; у мышей и кроликов — раздельно по яйцеводам, а у овец, коз и крупного рогатого скота — по 2 —4 эмбриона каждому реципиенту. Используй методы блот-анализа, дот-блот-анализа и ПЦР, можно получит* вполне надежные доказательства интеграции и экспрессии ДНК у трансгенных животных. С этой целью используют ядросодержа- щие клетки тканей или внутренних жидкостей реципиента, иг которых выделяют ДНК. . Для исследования у трансгенных животных выделяют РНК а тех тканей, в которых предполагается наиболее высокий уровень экспрессии. Качественный и количественный анализы экзоген ных белков позволяют судить об уровне трансляции инъецированного генного материала. Генетический анализ родившихся трансгенных животных Я полученного от них потомства показал, что, несмотря на инъек цию ДНК на ранних стадиях, в трансгенных линиях могут появ ляться так называемые мозаики. К мозаикам относят животных происходящих из одной зиготы, но имеющих разные генотипй Помимо клеточных линий, содержащих трансген, они имеют ещ и нетрансгенные клеточные линии. Подсчитано, что около 30 Я первичных трансгенных животных, полученных методом микр(| инъекции ДНК, — мозаики, что затрудняет создание чистых траЩ генных линий животных. Этим объясняется тот факт, что трансге! не передается потомству с ожидаемой в соответствии с закона» Менделя частотой 50 %. Часть мозаиков вообще не может дать на чало трансгенным линиям, так как у них отсутствует передача трансгена по наследству. Одна из важнейших задач сельскохозяйственной биотехнологии — выведение трансгенных животных с улучшенной продуктивностью и более высоким качеством продукции, резистентностью к болезням, а также создание так называемых животных-био- реакторов — продуцентов ценных биологически активных веществ. Каковы же успехи биотехнологии в этом направлении? С генетической точки зрения особый интерес представляют гены, кодирующие белки каскада гормона роста: непосредственно гормон роста (ГР), рилизинг-фактор гормона роста (РФ) и инсулинпо- добный фактор ГР (ИФГР). В конце 70-х годов XX в. на основе технологии рекомбинантной ДНК получили гормон роста микробного происхождения. Было показано, то ГР оказывает такое же стимулирующее действие на лактацию и рост животного, как и гипофизарный ГР. Гормон роста, полученный с помощью методов генетической инженерии, при крупномасштабном применении вызывал увеличение удоев на 23 — 31 % при дозе 13 мг в день. Разработаны формы препарата пролонгированного действия, позволяющие использовать его один раз в две недели и даже в месяц. При ежедневной инъекции ГР молодняку крупного рогатого скота, свиней и овец удалось увеличить суточные привесы на 20 — 30% при значительном сокращении расхода кормов на единицу прироста. У молодняка свиней с ускорением роста увеличивалось содержание белка и уменьшалось содержание жира в тканях, что повышало качество мясопродуктов. Первые трансгенные мыши с геном ГР были получены в 1982 г. У них отмечалось повышение скорости роста и увеличение конечной живой массы. Однако у трансгенных свиней с геном ГР (1989) увеличение роста не наблюдалось. По данным Л. К.Эрнста (1996), у трансгенных свиней с геном рилизинг-фактора гормона роста (РФ ГР) конечная живая масса была на 15,7 % выше по сравнению с контрольными животными. У потомства трансгенных свиней, получавших модифицированный кормовой рацион с повышенным содержанием белка (18% сырого протеина) и с дополнительным количеством лизина, отмечались более высокие среднесуточные привесы (на 16,5 %). жүктеу/скачать 5 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|