Тақырыбы: Эксплантты іn vіtro жағдайында өсіру. Микрокөбейту.
Дәріс тезистері: 1. Вируссыз тұқым шаруашылығы
2. Меристемадан өсімдіктің өсіп шығуы (регенерациясы).
3. Микрокөбейту жұмыстары
Вируссыз негіздегі картоп тұқымының шаруашылығы – тауарлы шаруашылықтағы оның өнімділігі мен сапасын арттырудың ең тиімді жолы.
Вируссыз тұқым шаруашылығы бірқатар сатылардан тұрады:
1. Картоп сортын сауықтыру. Осы мақсатпен апикальді меристема әдісі немесе оның термо немесе химиотерапиямен байланысы кең көлемде қолданылады.
2. Зертханалық және жылыжайларда сауықтырылған өсімдіктер мен түйнектердің жедел көбеюі.
3. Біріншілік және таңдаулы тұқым шаруашылығымен айналысатын маманданған шаруашылықтардың қажеттілігін қанағаттандыратын көлемде далалық жағдайдағы меристемалық клондардың бір-екі жылдық көбеюін біріккен клонды материалдардың зақымданғанын бақылау арқылы алу.
4. Жоспарланған көлемде картоптың супер-супертаңдаулы және таңдаулы түрлерін алғанға дейін өнімнің сапасын сақтауға және қайталанатын инфекциядан сақтауға бағытталған арнайы технологияны сақтау арқылы арнайы тұқым шаруашылығында сауықтырылған негізгі материалды көбейту.
Бірінші әдістемелік нұсқаулардың шыққан уақытынан бастап, ұштық меристема әдісін қолдану арқылы картоп сорттарын сауықтыру технологиясы біздің еліміздегі біріншілік-таңдаулы тұқым шаруашылығының негізгі бөлігі болды.
Осы уақыт аралығында бірқатар ғылыми-зерттеу мекемелері картоп сорттарын сауықтыру, сауықтырылған негізгі материал өндірісі және онымен картоптың тұқым шаруашылығын қамтамасыз ету жөнінде үлкен жұмыстар атқарылды.
Жеке элементтердің, сонымен қатар бүкіл технологияның жетілдірілген әдістемесі келтірілген. Бұл вируссыз негізгі материал алу өндірісін тиімді шешуге мүмкіндік береді.
Меристеманы түйіннің жасыл немесе этиолирленген өскіндерінен бөліп алады. Меристеманың жасыл өскіндерден түзілуі техникалық процесс, онда олар жақсы ажыратылады және түзілуі кезінде зақымдануға төзімдірек болады. Бірақ этиолирленген түйінді қолданғанда сауықтыру жұмыстарының эффективтілігі жоғары болады, себебі мұндай өскіндердегі вирустар концентрациясы айтарлықтай төмен, сондай-ақ вирусы жоқ ұштық меристема аумағы жарықта өсірілген өскіндердікінен әлде қайда көп болады. Түйіндер 2 см немесе одан үлкен болып өскеннен кейін оны бөліп алады.
Меристеманы өсіру жұмыстары сынапты-кварцті немесе БУВ типті бактериоцидті шамның көмегімен залалсыздандырылған микробиологиялық боксте жүргізіледі. Жұмысты бастар алдын жұмыс орнын (столды, бинокулярлы лупаны) және пробиркалары бар штативті спиртпен сүртеді. Өскіндермен жұмыс жасауға арналған құралдарды (пинцеттерді, скальпельдерді, инелерді) әрдайым қолданар алдында спиртке салып, содан соң от жалынына қару арқылы залалсыздандырып отырады.
Залалсыздандыру жұмысы сапалы болуы үшін КПГ-І типті ламинар-боксті немесе изотоптармен жұмыс жасау үшін арнайы жабдықталған плексиглазды бокс-камераларды қолданады. Өскіндерді меристеманы бөліп алар алдын 0,1% диацид ерітіндісінде залалсыздандырады (этанолмеркурхлорид пен ацетил пиридиний хлоридінің қоспасы). Диацид ерітіндісін бидистильденген суда даярлайды. Өскіндерді химиялық стаканға салып диацид ерітіндісін құяды да 3-5 мин залалсыздандырады, содан соң үш рет залалсыздандырылған сумен шаяды. Сондай-ақ 1-6% кальций гипохлоридінің ерітіндісімен немесе натрий не 0,1% сулема ерітіндісімен де залалсыздандыруға болады.
Дезинфекцияланған өскіндерді залалсыздандырылған Петри табақшаларына салып, солып қалмас үшін бірнеше тамшы автоклавталған су тамызады. Кескін кесіп алар алдын өскіннің ұшындағы ұштық жабын жапырақшасын алып тастайды. Бұл операцияны масштабты торы бар 24 есе үлкейтілген бинокулярлы микроскоптың астында дисцизионды медициналық иненің көмегімен жасаған дұрыс. Беттік жабындық қабаты (зачатков(примордий)) жоқ өлшемі 100-250 мк ұлпа кесіндісінен тұратын меристеманы цангалы ұстағышта қысылған кәдімгі жіңішке инемен бөліп алады. Сондай-ақ бұл үшін үшкірленген дисцизионды инені немесе циангалы ұстағышқа қысылған алмасты да қолдануға болады. Меристеманың ұшындағы да, жанындағы да өсу нүктелерін кесіп көруге болады. Беткі қабықшаны сылып алу мен меристеманы бөліп алу операцияларының әрқайсысын жеке-жеке залалсыздандырылған құралдармен жасайды. Кесіп алынған меристеманы иненің ұшымен пробиркадағы қоректік ортаның бетіне егеді. Сосын пробирканы жалынның үстінде тығынмен жауып, қайта штативке қояды. Барлығына егіп болғаннан соң штативті целлофан дорбамен ортаның кеуіп кетпеуі үшін жауып қояды. Қоректік ортаға егілген меристемасы бар пробирканы күнделікті жарық пен ылғал температуралық режимі бар арнайы камераға ауыстырады. Көбіне мұндай режимді сақтау үшін ауаны кондиционирлейтін қондырғысы бар люминесцентті шамдармен немесе меристема ұшынан өсімдіктерді өсіруге арналған арнайы жарықтық қондырғылармен (СУВР-Р, СВ-11 типті климаттық камералар) жабдықталған бөлмелерді қолданады. Бөлме температурасы РТ-2 және үш БК-1500 кондиционерінің көмегімен автоматты түрде реттеліп отыратын болса, онда көлемі 5×6 мбөлмеде бір мезгілде 6000 өсімдік өсіруге болады. Камераның температурасы 24-250С, жарықталуы 6±2 мың лк., фотопериоды – 16 сағ., ылғалдылығы - 70%-ға жуық болады. Меристемадан өсімдіктің жақсы өсіп шығуы үшін ең маңыздысы бұл оларды бөліп алу мен тұрақты режимі бар камераға қою арасындағы периодты қысқарту. Меристеманы егіп, одан 5-6 жапырақты өсімдіктің өсіп шығуына кететін уақыт 30-45 күнді құрайды, бірақ кейбір меристемалар тіршілікке бейім бола тұра 2-8 айда өсімдікті регенерацияламайды.
Өсімдік толық өсіп шыққанға дейін меристемадан өсіп шыққан өскіндерді дәл сол ортаның жаңасына не құрамы басқа ортаға ауыстырып отырғызады.
Алынған 5-6 жапырақты өсімдікті бөліп, әр жапырақшаны өсімдік өсіп шығуы үшін қоректік ортасы бар пробиркаларға отырғызады. Сонымен, бір уақытта регенерант-өсімдіктерге электронды-микроскопиялық бақылау жүргізеді.
Препараттарды даярлағанда бірінші және одан кейінгі кескіндерді отырғызу барысында өсімдіктің төменгі бөлігінен жапырағы жақсы жетілген бір кескінді іріктеп алады. Нақты толық нәтижеге қол жеткізу үшін әрдайым 2-4 препараттан тізбектеп отырғызу кезінде кем дегенде үш рет диагностикалау қажет. Бақылау үшін иммуноферментті анализдің in vitro зақымданған өсімдігін қолданған кезде жақсы нәтижелер алынды (ELIZA-TEST). Вирусы бар регенерант-өсімдіктерді алып тастайды. Вирусы жоқ өсімдіктерді шартты белгілермен белгіленіп, in vitro кескіндеу арқылы көбейтеді.
