Бақылау сұрақтары: Вируссыз тұқымшаруашылығының сатылары?
Микрокөбейту жұмыстары?
9
Тақырыбы: Клондық микрокөбейту əдісін қолдану жəне оның болашағы.
Дәріс тезистері: 1. Клондық микрокөбейту әдісін өсімдік өсіруде пайдалану
2. Микрокөбейтудің барлық кезеңдері
3. Микротүйнектер арқылы көбейту
Өсімдіктерді көбейтудің дағдылы вегетативтік әдістерімен салыстырғанда клондық микрокобейтудің артықшылығын келтірген.
Өсу коэффициентінің жоғарылығы. Бір гербари өсімдігінен дағдылы әдістерді қолдану арқылы жылына 50-100 өсімдік өсірілсе, ал ұлпаларды қоректік ортада көбейту арқылы 1 млн. өсімдік алуға болады; алманың бір жоғарғы бүршігінен 8 айдың ішінде 60 мың өскін алуға болады.
Өсімдіктерді жыл бойы өсіруге болады:
Әдіс өте тиімді және үнемді. іп vitro жағдайында кішірек лаборатория көлемінде мыңдаған өсімдік өсіруге болады.
Өсімдіктерді көбейтумен қатар оларды вирустар мен патогендік микроорганизмдерден сауықтыру бірге жүретіндігі.
Ұлпаларды іп vitro өсіру арқылы вегетативтік жолмен өте қиын немесе тіпті көбеймейтін өсімдіктерді, мысалы, пальманы көбейтуге болатындығы.
Осы келтірілген артықшылықтарына байланысты клондық микрокөбейту әдісін өсімдік өсіруде және селекцияда мынандай мақсаттарға қол жеткізу үшін пайдалануға болады:
1. ауыл шаруашылығы дақылдарының белгілі сорттарын тез және нәтижелі түрде көбейту;
2. көбею коэффициенті төмен құнды екпе және жабайы ағаштар тұқымдары дәндері арқылы көбейгенде ұрпактары белгілері бойынша ажырап кететін, ал дағдылы әдістер мен вегетативтік түрде көбейюі өте жай немесе тіпті көбейтілін өсімдіктерді көбейту;
3. гетерозистік будан тұқым өндірісі үшін линияларды нәтижелі түрде алу және көбейту;
4. вирустардан және патогендік микроорганизмдерден тазартылған, шаруашылык әсемдік дақылдардан көшет материалды алу және оларды аурулардан сақтау;
5. кұнды таңдаулы өсімдіктерден генетикалық жағынан бірдей ұрпақ алу мақсатында көбейту, мысалы, гаплоидтық өсімдіктерді, жасушалық және гендік инженерия әдістері арқылы кұрастырылған бірлі-жарым өсімдіктерді көбейту;
6. көп мөлшерде жасанды тұқым алу. Жасанды тұқым деп, даму кезеңдері бірдей жасанды қабықшалармен қапталған, эмбриоидтарды атайды. Қабықшалар эмбриондарды қолайсыз жағдайлардан берік қорғайды және ұзақ уақыт аралығында тіршілік қабілетін сақтауын камтамасыз етеді. Әзірше бұндай "тұқымдарды" лаборатория жағдайында аз мөлшерде алып, тек ғылыми- зерттеу және селекциялык жұмыстарда қолдануда. Биотехнология бұл "тұқымдардың" өте көп мөлшерде алынуын қамтамасыз етуі керек.
іп vitro көбейтудің этаптары микрокөбейтудің барлық бастапқы
өсімдіктерді клондау арқылы процесстерін 4 кезеңге бөлуге болады.
Бірінші этап. Өсімдіктердің бастапқы ұлпаларының экспланттарын іп үІіго өсіру. Бұл кезеңде қоректік ортада инфекциядан таза ұлпаларды өсіріп, олардың тіршілігін сақтап, экспланттардың тез өсуіне қол жеткізу керек. Өсімдіктерді көбейтуде жетістікке жету, эксплантты дұрыс тандап алудан басталады, бұл кезде донорлық өсімдіктің өсу фазасы және өсу жағдайларын ескеру керек.
Екінші этап. Нактылы микрокөбейту кезеңі, яғни эксплантта бастама жасушалар /инициальдар/ санын көбейтіп, олардан өркендердің пайда болуына жағдай жасау.
Үшінші этап. Көбейтілген өркендерді тамырландыру және оларды сақтау. Бұл кезенде тамыр жүйесінің қалыпты өсуіне толык жағдай жасалады, қоректік ортаға тамыр пайда болуына жауапты фактор-ауксин косылады. Одан кейін өсімдіктерді топыраққа отырғызуға дайындау басталады немесе сақтау үшін төмен температура жағдайына ауыстырады. Онда өсімдіктің өсуі тежелінеді,темекі теңбіл кеселі вирусының концентрациясы өсімдіктің жоғарғы ұшына карай азая беретінін анықтады. Өсімдіктердің жартысында өркенінің жоғарғы ұшында немесе аппикальдық меристемаларында вирус табылмаған. Вегетативтік жолмен көбейетін дақылдарды вирустық аурулардан сауықтыру үшін, апикальдық меристемаларды өсіру әдісін колдану 1952 жылы Морель мен Мартин жұмыстары арқасында басталды. Олар бұл әдісті теңбіл кеселі вирусынан георгинді сауықтыру үшін пайдаланды.
Меристемалық ұлпаларда вирустардың көбею қабілеті төмен екендігі туралы біркелкі пікір жоқ. Меристемаларда вирустардың жоқ болуы, кейбір зерттеушілердің пікірі бойынша, өсімдіктің жоғарғы ұшының меристемасында өткізгіш жүйенің жоқ болуынан, ал гоазмодесмалар көлемі өте кіші немесе тіпті жоқтың қасы, сондықтан вирустардың жасушадан жасушаға ауысуы тежеледі. Басқа ғалымдар бұл фактіні вирус нуклео- протеинінің синтезін жүргізбейтін меристемалық жасушалардың ерекше метаболизмінен деп түсіндіреді. Жылумен өңдеу арқасында /34-40°С/ өсіп келе жатқан өркеннің ұшында вирустардың көбеюінің тежелуі жағдай, меристема дифференциланғанда вирустардан таза жасушалардың пайда болуы мүмкін. Вирустардан таза өркеннің өсіп шығуы үшін, донорлық өсімдіктерді /апикальдық меристема алынатын өсімдіктер/ өңдеуде табысқа қол жеткізу үшін, жоғары өсуіне жақсы жағдай жасап, 34-40°С температурада неғұрлым ұзақ ұстау керек.
Өсімдіктерді жылумен өңдеп оның меристемасын жасанды ортада өсіріп, міндетті түрде вирустарды тексеру қажет, ол үшін түрлі әдістер қолданылады. Оның біреуі - вирусты айқындаушы өсімдіктер - вируспен зақымданған өсімдіктен бөлінген шырынды тамызғанда, арнайы сезімталдық реакция арқылы жауап беретін өсімдіктер. Вирустарды анықтаудың электрондық микроскоптан әдісі өте жоғарғы дәлдік көрсететіні анық, бірақ бұл жол өте қымбат және көп еңбек сіңіруді қажет етеді, сондықтан сан жағынан көп мөлшерде өсімдіктерге бақылау жүргізу үшін күнделікті тәжірибеде қолдануы мүмкін емес. Вирустарды анықтауда сезімталдығы өте жоғары иммуноферменттік талдау болып табылады, ол " антиген-антидене " комплексінің ферменттік активтігін аныктауға негізделген. Бірақ ол үшін арнайы реактивтер жиынтығы қажет. Серологиялық әдіс арқылы вирустарды жылдам анықтау мен бірге ерекшелеуге болады. Дегенмен, бұл әдістің сезімталдығы орташа және барлық вирустарды анықтауға арналған сывороткалар жоқ.Егістік дакылдарды және жеміс-жидектерді, сәндік өсімдіктерді сауықтыру үшін жылумен өңдеуді және меристемаларды жасанды ортада өсіруді қатар қолданып, таза өсімдіктерді вирустарды анықтау арқылы іріктеп алу жұмыстары комплексті түрде жүргізілуі керек. Г. Лейке т.б. көрсетулері бойынша, тәжірибелерде қолдануға болатын, вирустардан тазартылған материал алуда табыска қол жеткізудің негізгі шарттары төменде көрсетілгендей.
І. Материалды жылумен өңдеу мүмкіндігі. 2. Меристемаларды жасанды қоректік орталарда өсіруге болатындығы. 3. Вирустарды аныктауға арналған жоғарғы дәлдігі бар тесттердің бар болуы. 4. Сауықтырылған өсімдіктің көбею коэффициентінің жоғары болуы. 5. Қайтадан вирустармен зақымдалмауы үшін, сауықтырылған бастапқы материалды толық оқшауланған жағдайда көбейтуді ұйымдастыру. 6. Бастапқы материалды жыл сайын алмастырып отыру үшін вирустардан тазартылған материалдың жеткілікті мөлшері қажет. Әртүрлі дақылдарда осы көрсетілген шарттардың орындалуы бірдей емес. Қазіргі уақытта осы әдісті қолдану аркылы шаруашылықтарда пайдаланып, сүрген картоптың барлық бағалы сорттары сауықтырылған және алдыңғы қатарлы елдерде тұқым шаруашылығы тәжірибесінде кең қолданылады.
Вирустардан тазартылған картоп өндіру технологиясы картоп түйнегінің термотерапиясынан басталады. Вирустардың тиюіне байланысты жылумен өңдеу 7 күннен 7 апта бойына жүруі мүмкін. Түйнектер сондай-ақ вирустарға қарсы ингабиторлары мен және түйнектердің өсуі үшін стимуляторлармен өңделеді. Меристемалардың ұсақ бөлшектерін алу үшін, ұзындығы 3-5 " болатын түссіз немесе сәл ғана жасыл өркендерді пайдалана зарарсыздандырылған бокстың ішінде сырттай зарарсыздантылған және жуылған негізгі өркендерді бірнеше бөлшектерге бөледі. Мөлшері 50-100 мкм меристемалауды оқшаулау тәжірибе жүзінде мүмкін емес, сондықтан меристемалармен бірге бүршіктегі бастапқы жапырақта оқшауланады, сондықтан оның мөлшері үлкейіп 500 мил жетеді, одан да үлкен болады. Осы мөлшерінің үлкен болуынан вирустардан таза экспланттар алу мүмкіндігі төмендейді, бірақ меристемалардың дифференциялану дәрежесі артады.
Агарланған қоректік ортаға отырғызылған аспек егер өсіп жетіледі де, кейін ұзындығы 0,3- 0,5 см өскіндер пайда болғанда оларды тамыр түзілуі және өсуді ынталандыру үшін, жаңа қоректік ортаға ауыстырып отырғызады 5-7 жапырағы шыққаннан кейін, бұлөсімдіктерді қалемшелейді, әрбір қалемшөп құрамы жағынан шығыңқы қоректік ортамен бірдей қоректік ортасы бар пробиркаларға отырғызады. Бір қалемше вирустардың бар-жоғын анықтау үшін пайдаланылады. Таза өсімдіктер картоптың вируссыз линияларын беретін негіз салушылар болады. Таза линияларды көбейтуді тездету үшін, жүйелі түрде қалемшелеу әдісін қолданады. Меристемаларға тарапында қалемшелерден өсімдіктердің өсіп жетілуі әжептеуір тез, тамыр жүйесі өте мықты және жапырағының саны да көп болады. Өсімдіктерді пробиркаларда қалемшелеу әдісін қолданып 2-3 ай ішінде 2-3 мың өсімдік өсіріп алуға болады.
Осы өте нәзік өсімдіктерді /супер-супер элита/ әрі қарай сақтауға қояды немесе теплицаға топыраққа отырғызады. Ескеретін жағдай, жұмыстың бұл кезеңі жауапты болғандықтан ұқыптылықты талап етеді. Л. Н. Трофимецтін қызметкерлерімен бірге анықтауы бойынша, колайлы жағдай жасалса сортты сауықтыру үшін орташа шамамен 40 апекстің меристемалары жеткілікті және 7-8 ай ішінде іп vitro жағдайында 30-40 мың түйнек алынады деп есептейді. Сауықтыру тиімділігі көбінесе сорттык ерекшелікке, вирустармен бастапқы зақымдануына, жыл мерзіміне т.б. жағдайларға тәуелді.
Оқшауланған жағдайда тештицада көбейтілген өсімдіктер суперэлита болады, одан кейін суперэлиталық тұқым алынатын орындарда көбейтіледі. Іріктеліп алынған таңдаулы өсімдіктер элита өндірістік питоминктерде көбейтіледі және олардан алынған түйнектер /тұқымдык материал/ өндірістік негізде өнім алу үшін шаруашылықтарға беріледі. Бірақ 5-6 жыл аралығында тұқым қайтадан вирустармен зақымданады, сондықтан, жаңадан сауықтырылған тұқымдық материал қажет болады. Соңғы кезде көбейту тиімділігін арттыру максатымен сауықтырылған өсімдіктерді микротүйнектер арқылы көбейту әдісі жүзеге асырылуда. Ол үшін қалемшелерді құрамы ерекше ортаға отырғызып, 10-15° С температуа,да ұстайды. Соның нәтижесінде 3-8 апта ішінде жапырақтар қолтығында көптеген бұршақтай микротүйнектер түзіледі. Оларды сақтау да оңай және топыраққа отырғызғанда шығыны болмайды.
Зерттеушілер картоп өсімдігін сақтау үшін, каллустық ұлшіны пайдалануға да тырысуда. Каллустарды қайталап жаңа коректік ортаға отырғызу кезінде каллус жасушалары вирустардан тазарады және табиғи немесе жасанды түрде индукцияланған морфогенез жүреді де, таза регенерант өсімдіктері шығады. Кейбір сорттар үшін каллусты коректік ортада өсіру әдісі, апикальдык, меристемаларды өсіргенге қарағанда тиімділігі жоғары екені анықталған (Сурет 9). микротүинек- микротүтіктер терді сактау 4о С
9 Сурет. Картоп өсімдігін сауықтыру және микротүйнектер арқылы көбейту ұлпаларды қоректік ортада өсіріп фитонаюгендік инфекциялардан таза тұқымдык материал алудың әдісі бірқатар көкөністік, жеміс-жидектік және сәндік дақылдар үшін жете зерттеліп, әдістемелері жасалған. Меристемаларды мұздатып сақтау /сұйық азотта- 196"С температурада/, қаржымен өндірістік орын, еңбекті үнемдей отырып бастапқы материалдың генетикалық тұрақтылығы сакталатын, инфекциялардан таза генофоид коллекциясын ұстауға мүмкіндік жасайды. Аурулардан таза тұқымдық материалдар қолданып, өсімдік шаруашылығының тиімділігін арттыруға болады. Тиімділіктің артуы болашақта өсімдіктерді сауықтырудың өндірістік биотехнологиясының негізін қалайтын болады.
