Бақылау сұрақтары: Каллус туралы жалпы түсінік?
Компетенция дегеніміз не?
Меристемалық жасушалардың атқаратын қызметі?
Гендер активтілігінің алты деңгейін сипатта.
5
Тақырыбы: Іn vіtro жағдайында өсетін өсімдік жасушаларының биологиясы, дифференциялану Дәріс тезистері: 1 Қоректік ортада өсірілген жасушалар биологиясы.
2. Дедиффереңциялану және каллустың түзілуі
3. Жасанды ортада өсірілген жасушалардың әр түрлілігі.
4. Жасушалардың жасанды ортада өсуі.
1. Көп уақыт бұрын бөлінуін тоқтатқан ұлпалардың дифференцияланған жасушалары қайтадан митоз жолымен бөліне бастағанын көрсетеді. Маманданған, бөлінбейтін жасушалардың қайтадан бөлініп, жаңа жасушалар мен ұлпалар түзу жағдайына ауысуы - дедифференциация деп аталады. Бұл процесстің негізі, ол дифференциациядағы сияқты гендердің активтігінің өзгеруіне байланысты. Жасуша атқаратын қызметінің өзгеруі, гендер активтілігнің өзгеруіне байланысты. Осы уақытқа дейін іске косылмаған геңдердің активтенуі және бұрын жүмыс істеп тұрған кейбір гендердің тежелуі себебінен, жасушадағы құрылымлдық белоктар мен ферменттердің құрамы өзгереді. Қоректік ортада міндетті түрде фитогормондар / соның ішінде ауксиндер/ болған жағдайда жасушалар дедифференцияланып каллустың жасушаларға айналады. Маманданған жасушаның дедифференциялануының бірінші этапы ол жасушаның бөліну қабілетінің қалпына келуі. Дедифференциациялану және каллус түзілу механизімін зерттеп білетін модель ретінде жасанды ортада өсірілген темекі сабағының өзектік паренхимасын пайдаланған өте қолайлы. Себебі, өзектік паренхимада бөлінуді козғау мен каллус түзуші үшін ортада ауксин мен цитокининнің қатысуына қатан тәуелділік бар.
Дедифференциялану калай жүреді? Р.Г.Бутенконың келтіруі бойынша, қоректік ортада өсірілген темекінің өзектік паренхима жасушаларының дедиф- ференциялануы, қоректік қор заттарды пайдаланудың және жасушаның арнайы маманданған органеллаларының бұзылуынан басталады. Маманданған жасушаның өз қасиетін жоя бастағаннан /дедифференциялану/ кейін 6-І2 сағ. өткен соң олар жасушаның нәзік құрылысында болатын өзгерістерді бақылаған. Жасуша қабығы жұмсарып, ісінген, рибосомалар саны, эндоплазмалық тор және Гольджи аппараты элементтерінің саны өскен, ядрошықтың көлемі және саны көбейген. Жасушаларда тРНҚ және рРНҚ синтезі артып, ДНҚ синтезі басталған, жаңадан түзілген белоктардың мөлшері көбейген. Бастапқы ұлпаларға тол емес, арнайы белоктардың-антигендердің пайда болуы, әсіресе тұтас темекі өсімдігінің меристемалық белогының біріне сәйкес белоктың синтезделуі анықталған. Осы өзгерістердің барлығы, одан кейінгі жасушаның бөлінулері тек ортада ауксиндер мен цитокининдердің катысуымен ғана жүреді. Жасуша бөлінулері 48-72 сағат өткеннен соң басталатыны белгілі болды. Дмитрева Н.Н мен Линский А.Х. темекінің өзектік паренхима жасушасың циклді бөлінуіне гормондар әсерінің мерзімдік жүйелілігін анықтады, ол үшін ауксин мен кинетин әсері жеке-жеке зерттелді. Қоректік ортаға бір ғана ауксинге қосылған жағдайда, РНҚ және ДНҚсинтезделуі күшейгенімен, жасушалардың бөлінуі байкалмады, төрт күндік латентті / жасырын / фазадан кейін жасуша созылып өсуге айналды. Қоректік ортада тек бір ғана кинетин қосылған жағдайда нуклеин қышқылдары синтезінде ешқандай өзгерістер байкалмаған. Жасушаның бөлінуіне кажет барлық процесстер жүру үшін, ауксиннен кейін кинетиннің әсері болу керек немесе екеуінің қосылған әсері қажет. Зерттеулерден кейін мынадай қорытынды жасауға болады, жасушаның бөліну процессін тек кинетин бастап жібереді. Р.Г.Бутенконың үйғаруы бойынша жасушаның бөлінуі төменгі жағдайларды қамтиды: жасушалардың көбею стимуляторы /ауксин/ әсерінен жасушаның сырткы мембранасы плазмалемманың өткізгіштігі артады да, оның қасиеттері өзгереді. Осыдан соң бұрыннан бар болған немесе жаңадан синтезделген матрицалық РНҚ-да цитоплазмалық белоктардың түзілу барысы активтенеді. Түзілген белоктар цитоплазмадан ядроға өтеді, арнайы гистондық белоктармен ерекше байланысқа түседі де , транспорттық және рибосомдық РНҚ-лары ситезделуіне жауапты локустарды іске қосады. Жасушадағы РНҚ-ның мөлшері белгілі бір сатылы деңгейге жеткенде ДНҚ-ның репликациясы басталады. Ортада кинетин болмаған жағдайда жасушаның митозға өтуі болмайды. Шамасы, кинетин жасушаның митозға өтіп бөлінуін аяқгау үшін қажет, арнайы РНҚ-лары мен белоктардың сиитезделуін белгілейтін болу керек. Ондай бөлінуге ықпал жасайтын премитоздық кезеңде синтезделген белоктың және оған сәйкес информациялық РНҚ-ы бар екендігі жануарлар жасушаларында дәлелденген.
Сонымен кез келген жасушаның өзгеріп, каллустық жасушаларға айналуының алдында, көптеген күрделі биохимиялық және структуралық кайта құрылулардан өтеді. Дегенмен, өсімдік жасушаларының маманданған касиетін жойып, бөліне бастау /дедиференциялану/ процессінің терең механизмдері жете зерттелген жоқ.
Жаңа өсімдік материалынан бірінші рет каллус алу өте қиын, себебі әр түрлі өсімдіктердің ұлпалары, тіпті бір өсімдіктің әр бөлігінен алынған ұлпаларының дедиференциалануы және каллусогенезі жүру үшін, әр түрлі қоректік орталарды талап етеді, әсіресе ондай талап гормондардың мөлшері мен ара қатынасына қойылады. Кейбір өсімдіктердің, ұлпаларын кайталап отырғызып ұзак, мерзімде өсіргенде, ондай ұлпалар әжептәуір мөлшерде ауксин мен қатар цитокининді синтездеу қабілетіне ие болады, яғни бұл гормондарға байланысты автотрофтарға айналады. Бұндай каллус жасушалары "қалыптасқан",-деп аталады. Гормондарға тәуелсіз штаммдардың пайда болу себебі өлі белгісіз. Олардың шығуы мутациялардың әсерінен, немесе жаңа гендердің іске қосылуынан болуы мүмкін. Ісік жасушаларын жасанды ортада өсіргенде, оларда гормондарға тәуелсіз.
Жасушаларды қоректік ортада өсіргенде каллустық жасушаларға айналады, бірақ ондай жағдайда барлық жасушалар біркелкі болмайды. Жасанды ортада өскен жасушалардың түрлілігі/гетерогенді/ морфология, физиология және генетика түрғысынан болуы мүмкін.
Каллус жасушаларының бастапқы ұлпа жасушаларынан және бір-бірінен өлшемі және формасы жағынан айырмашылыктары бар, олардың ядросының саны мен формасы тұрақты емес. Қоректік ортада өскен жасушалардың полиморфизмі мынадай себептерден пайда болуы мүмкін. Түрдің және өсу мерзіміндегі ерекшеліктері, алғашқы плоиттылық деңгейі, қоректік орта құрамы және өсіру жағдайларының тигізетін әсері, клетклар арасында корреляциялық байланыстардың жойылуы. Қартайған каллустың жасушаларының мөлшері өте үлкен шамаға дейін жетеді/500-1000мкм/, жас жасушалардың мөлшері айтарлықтай кіші/15-30мкм/. Ортада кинетин болмаған жағдайда көбінесе жасушалардың мөлшері үлкейеді. Жасушаның пішіні мен мөлшерінің және ядроларының өзгеруі, ол плоидтылығының көбеюіне байланысты. Жасушаларды жаңа ортаға қайталап отырғызып өсіру /пассаж/ саны көбейген санын плоидтылығы артатыны дәледденген.
Физиологиялық әр түрлілік деген ол популяциядағы клекалардың әртүрлі физиялогиялық жағдайында болуы, яғни олар бөлінеді, өседі, картайып, өледі. Сейтіп ортада өскен жасушалар асинхронды келеді /бөлінуі бір уақытқа сәйкес келмеуі/. Жоғары сатыдағы өсімдіктер популяциясындағы жасушаларды жасуша циклі фазаларын бір кезде өтуге мәжбүр ету, яғни синхрондаумүмкіндігі жок деуге болады. Себебі, бір мезгілде бөлінуге қабілетті жасушалардың бөлігі 2-4 құрайды. Қолайсыз жағдайлар төменгі температура, қоректік ортада негізгі компоненттердің жетіспеуі жасушалар бөлінуін тежейді және бөлінуге дайын жасушалар санының көбеюіне себепші бола алады. Жасушаны бөлуге дайындық кездерінің бірін тежейтін химиялық заттарды қолданған тиімді. Клекалардың бөлінуінің синхрондалуының жоғары деңгейі 10-30%-ке жетуі мүмкін, бұл өте жақсы жағдай, бірақ келесі бөлінулер кезінде популяция өзінің бір мезгілде бөліну қасиетін тез жояды.
Көңіл аударатын жай, ол сұйық қоректік ортада /суспензияда/ өскен жасушалардың физиологиялық өзгергіштіктері, агарланған қатты ортада өскен каллустың ұлпаларымен салыстырғанда төмен. Ол жасушалардың қоректену мен аэрациялау жағдайларының бір келкілігіне және жасушалар бөліп шығаратын зиянды зат алмасу өнімдерінен, сұйық араласып тұрған ортада оңай құтылуына байланысты.
Жасанды қоректік ортада өскен жасушаларға цитогенетикалық тұрақсыздық та тән. Бір ыдыста өсірілген, бір ұлпа жасушаларыньң хромасомалар бір-бірінен айтарлықтай айырмашылығы /диплоидтар, полиплоидтар, анеуплоидтар/ болуы мүмкін. Генетикалық өзгергіштіктің себебі әр алуан. 1. Өсімдіктен бастапқы эксплантты бөлген кезде үйлесімді /коррелятивтік/ байланыстардың бұзылуынан, 2. қоректік орта компоненттерінің әсерінен, 3. коректік ортаға бөлінген метаболизм өнімдерінің әсерінен, 4. сегізгі материалдың гетерогенділігі және бөлгіш жасушалар типтерінің сұрыпталуы.
Жасанды жағдайда өсірілген жасушалардың цитогенетикалык гетерогенділік механизмі жалпы түрде анықталған. Оларға жататындар: 1/ жасушалық сұрыптау процессі; 2/ жасушалардың бөлінуінде эндомитоз бен эндоредупликация құбылыстары; 3/ митоз кезінде жасушада жүретін жағымсыз өзгерістер. Жоғарыда келтірілген үш процесстің әр қайсысы бір-бірінен тәуелсіз жүре алады. Жасушалық сұрыптау, ол популяциядағы жасушалардың белгілі типінің көбейіп басым болуы. Ондай басым болу жасушалардың бір бөлігінің айрықша бөлінуінен немесе басқа жасушалардың тез жойылуынан болуы мүмкін. Эндомитоз және эндоредупликация /басқа атаулары эндоциклдер/ тек қана жасушаның жаңадан түзілуіне, яғни пролиферацияға байланысты болады. Бұл екеуі де митоздың формалары, олардың ерекшелігі ол карио және цитокинездің өтпейтіндігі, және ядродағы ДНҚ-ның мөлшері геометриялық прогрессия бойынша көбейетіндігі. Қалыпты митоздың бұзылуы мен хромосомалардың дұрыс бөлінбеуі, полиплоидтық және анеуплоидтық жасушалардың түзілуіне әкеліп соғады.
Ең негізгі себептердің бірі, шамасы, ол бүтін организмнен бақылау болмауына байланысты болу керек, яғни корреляциялық байланыстардың бұзылуы себебінен жасушалар өзгереді. Тіршілікке қабілетті полиплоидтық жасушаларды сұрыптау арқылы, жасушалар популяциясы жаңа жағдайға бейімделеді. Жасанды қоректік ортада өсіру жағдайы өзгергенде, сұрыптаудың бағыты да өзгереді, бұл ескеретін жағдай. Мысалы, ортадағы 2,4-Д және юшетиннің жоғары концентрациялары жасушалардың полиплоидтану мумкіндігін арттыратыны анықталған.
Жасанды ортада өсіру жағдайынын цитогенетикалық көп түрліліктің /гетерогенділігін/ пайда болуына әсер ететіндігін гаплопаппус өсімдігі ұлпасымен жасалған тәжірибеден анық көруге болады. Осы өсімдіктің меристемалық жасушалары Р.Г.Бутенконың лабораториясында екі жыл бойы үзбей әрбір ай сайын жаңа ортаға отырғызу арқылы өсірілген. Сондықтан да, негізгі өсіруге алынған диплоидты жасушалардың 95%-і жоғары плоидтылықка айналған. Осы ұлпамен жұмыс жасаған швед зерттеушісі Эриксон, әрбір екі күн сайын жаңа қоректік ортаға отырғызып отырған. Бұндай жағдайда штамм бір қалыпты диплоидты күйін сақтап калған. Дегенмен, өсімдіктерді өсіру тәсілдері жасушалар популяциясының генетикалык тұрақтылығының толық кепілі бола алмайды, себебі негізгі материаддың екінші генетикалық әртүрлілігі, болуы әбден мүмкін. Көптеген өсімдіктердің дифференциалданған ұлпалары жасушаларының диплоидтылығы әр түрлі. Маманданған жасушалар, мысалы, жарық сәулесін сіңіретін жасыл жапырак паренхимасы, тамырдың етженді қорлық ұлпалары, түйнектер жасушалары көбінесе полиплоидтык, Тек белсенді түрде бөлініп жатқан жасушалар әр уақытта диплоидтылығын сақтап қалады.
Егер негізгі материал ретінде диплоидтық меристемалық жасушалар алынған болса және оларды үзілмейтін ағын коректік ортада өсірсе, сонда ғана олардың генетикалық тұрақтылығын сақтауға кепілдік бар. Экономикалық жағынан тиімді, қажеттігі зор, түрлі заттар алу мақсатымен ұлпалардың өте үлкен массасын өсіргенде, клонның генетикалық тұрақтылығын сақтаудың маңызы зор. Жасушаларды жасанды түрде өсіру барысында, өсімдіктің негізгі түрімен генетикалық пара-парлықты сақтау, бірегей, генетикалық жағынан бағалы өсімдіктер формаларын көбейткенде қажет екендігі белгілі. Сонымен қатар, жасушаларды модель ретінде физиологиялық және биохимиялық процестерді зерттеу үшін қолданғанда да олардың генетикалық тұрақтылығының маңызы зор. Демек, жасушаларды қоректік ортаға бірнеше қайталап отырғызып, өсіріп тіршілігін сақтағанда, оларда морфологиялық, физиологиялық, цитогенетикалық әртүрлілік пайда болады. Кайталап отырғызбай жасушалар штаммдарын өзгеріссіз сақтау жолының бірі мұздатып алып өте төмен температурада /-196°С /, яғни криогенді әдіспен сақтау.
Қалай дегенмен, жасанды ортада өсірілген ұлпалардың -генетикалық гетерогендігінің пайдалы жақтары да бар, ол жасушалардың адаптациялық мүмкіншілігін арттыратындығы. Жасушаларды жасанды қоректік ортада өсіргенде, полиплоидтық жасушалардың өздігінен сұрыпталуы /автосұрыптау/, яғни полиплоидтық жасушалардың спонтанды /табиғи/ сұрыпталуы жүреді. Ондай сұрыпталған жасушалар тіршіліктің жаңа жағдайларына тезірек бейімделе алады. Бұдан басқа, табиғи немесе қандай да бір факторлар әсері арқылы индукцияланған, өсімдіктердің түрліше варианттары бар формаларының пайда болуын, казіргі уакытта қолданып жүрген ауылшаруашылық дақылдарының сапасын жақсарту үшін колдануға болатыны. Қоректік ортада өсіріліп алынған жасушалар линияларының немесе регенерант өсімдіктердің көп түрлілігі сомаклондық өзгергіштік нәтижесінде пайда болады, оларды сомаклондык варианттар деп атайды. Сомаклондық өзгергіштік -өсімдік жасушаларының ядролық және органиодтық геномдарының тұрақты еместігінен болатын фенотиптік өзгергіштік.
Агарланған және де сұйық жасанды қоректік орталарда өсірілетін өсімдік жасушаларының негізгі типі, ол көбеюге қабілеті бар каллус ұлпалары. Кез келген негізгі ұлпалардан пайда болған каллус ұлпаларын өзіне лайықты қоректік ортада ұзақ уақыт бойы, тіпті шексіз өсіруге болады. Үзбей өсіру үшін әрбір 3-4 апта өткеннен кейін каллустарды жаңа қоректік ортаға отырғызып /пассаж жасап/ бағады. Дүниежүзінің көптеген лабораторияларында ондай каллустар өсірілуде. Мысалы, 1938 жылы сәбіздің тамыр жемістерінен Р.Готре алған каллус күні бүгінге дейін өсірілуде. Ескертетін жағдай, өсімдіктердің жеке жасушалары олардың кішкене топтарын /агрегаттарын/ өсіргенде, өсуге қажет қоректік заттарға қоятын талабы қатты ортадағы жасушаларымен салыстырғанда жоғары болады, өйткені агардағы жасушалар өзі тәріздес жасушалармен қоршалған. Жеке жасушалар араластырылып тұрған сұйық қоректік ортада бөлінуі үшін қажет, қандай да бір заттарын жоғалтады, сондықтан сұйық қоректік ортада өсірілетін жасушалар үшін орталардың құрамы өте құнарлы болу керек. Агарланған ортаға отырғызылған жеке жасушалар бөлінуге өту үшін, көмек ретінде "бағушы" ұлпаларды немесе "асыраушы қабаты" болуын қажет етеді және ортаға отырғызылатын жасушалар тығыздығы белгілі бір мөлшерден төмен болмау керек. Сұйық қоректік ортада өсетін бірен-саран жасушалар басқа жақсы өсіп жатқан жасушаларының ортасын қосқан соң ғана бөлініс бастайды.
Бүтін организмдер сияқты жасанды ортада жасушалардың өсуі 3 -тәрізді қисық сызықпен бейнеленеді және ол мынандай фазаларды қамтиды:
I/ латенттік немесе лаг-фаза, бұл фаза кезінде жасушалардың көрінетіндей өсуі болмайды, бірақ жасуша белсенді түрде суды және коректік заттарды сіңіреді де бөлінуге дайындалады. 2/ үдеу фазасы, бұл кезде жасушалар бөлініп созылып өсе бастайды; 3/ логарифмдік немесе экспоненциялдық фазасы, түзу сызыкпен бейнеленетін өте қысқа фаза, бұнда өсу жылдамдығы уакыт өткен сайын екі еселеніп үдейді; 4/ Жасуша өсуінің төмендеу фазасы, бұл фазада жасуша өсуінің салыстырмалы жылдамдығы бәсеңдейді; 5/ стационарлық немесе бір сарынды фазасы, бұл кезде жасушаның өсуі жылдам болмаса да тұрақты жүреді; 6/ жасушалардың біртіндеп жойылып құру фазасы.
Жасушалардың бір фазадан басқа фазаға ауысуы ішкі және сыртқы факторлардың катысуымен бақыланады. Ішкі факторларға жататындар: пролиферациялық қоры; жасушаның созылу ұзақтығы; циклға енген жасушаның жалпы күйі; жеке жасушалардың бөліну саны. Пролиферациялық қоры деп бөлініп жатқан жасушалар санының жалпы жасушалар санына қатынасын атайды. Бұл ара қатынасты процентпен белгілесе, онда ол митоздық индекс деп аталады.
Сыртқы факторларға жататындар : қоректік ортаның құрамы, рН-тың деңгейі, оттегінің мөлшері, температура, отырғызылған жасушалар мен ұлпалардың тығыздығы, т.б. факторлар.
Жасушалар мен ұлпаларды жасанды ортада өсіргеңде барлық жасушалар бірдей бөлінбейді, сондықтан пролиферациялық қоры төмендейді. Оны мынадай себептермен түсіндіруге болады:
1) жасушалардың қайтымсыз дифференциялануы;
2) жасушалардың С кезеңіне өтуі (циклден тыс немесе тыныштық кезеңі);
3) жасушалардың кұруы. Жасушалардың бөлінуі арқылы өсуі мен бір бөлігінің өліп жойылуы теңелгенде, жасанды ортада өсрілген жасушалар стационарлық (өсуі бір қалыпты өзгермейтін) күйде болады.
Өсу процессін түрлі факторлардың қатысуымен реттеуге болады және мынадай көрсеткіштер арқылы бақылауға болады: өлшем, көлем, масса, жасушалар саны, белоктың және ДНҚ-ның мөлшері. Тәжірибенің мақсатына байланысты, келтірілген көрсеткіштердін, біреуі қолданылады. Жасушалардың өсуін зерттеп білу үшін, белок пен ДНҚ мелшерін белгілі бір әдістермен анықтаған ыңғайлы және оны жасушалар санын анықтағанда да қолдануға болады.
