Бақылау сұрақтары: Жасушалық инженерия түсінігі, қалай жасалады?
Протопластар қалай алынады?
Протопластарды культивирлеу жолдары мен әдістері?
Оқшауланған протопластардың бірігу әдістері?
4
Тақырыбы: Каллусты алу жəне оны өсіру. Каллустың пайда болуына əсер ететін факторлар.
Дәріс тезистері: 1. Каллуc туралы жалпы түсінік
2. Бүтін өсімдіктердің өсуі
3. Дифференциялану.
4. Морфогенез процестерінің жүру принциптері
Кез келген өсімдіктің тірі ұлпасын қолайлы /лайықты қоректік заттар мен гормондары бар/ ортаға отырғызса, одан маманданбаған жасушалар колониясы пайда болады, оны каллус деп атайды. Каллус-қоректік ортадағы жасушалардың ретсіз бөлінуінің нәтижесінде пайда болған ұлпа. Бұрыннан бар жасушалардың көбейуінен жаңадан жасушалар мен ұлпалар тузілуін пролиферация деп атайды. Сөйтіп каллус пролиферацил нәтижесінде шығады.
Жасанды қоректік орта жағдайында, яғни іп vitro жағдайында өсімдіктердің барлық ұлпалар типтері жасушалары каллус жасушаларына айналады. Бұл процесс дифференциялану деп аталады, оның есебі фитогормондарға байланысты. Қөректік ортаның құрамын өзгерте отырып, ретсіз өсіп жатқан ұлпалардан регенерант- өсімдік алуға болады. Сонымен бір жасушадан тұтас бір өсімдікті өсіріп алуға болады, яғни өсімдік жасушалары ерекше касиетін – тотипотенттілігін көрсетеді.
Каллус ұлпаларының әр типті морфогенезге икемді болғандықтан оларды көптеп өсіреді. Каллустың түзілуі мен өсуін ауксиндер мен цитокиниңдер реттеп отырады. Көптеген жағдайда каллус түзілуі /индукциялау/ үшін кейінгі өсуге қарағанда ауксиндерді 10 есе артық қажет етеді. Каллус жасушалары өсу қарқындылығымен ерекшеленеді, түсі арқылы /ақ- ақшылдан -қара қоңырға дейін, тығыздығына қарай /бос- борпылдақ, тығыз, т.б. түрлері , жарықта түсін өзгертіп көгеретіндігімен тағы сол секілді белгілерімен бір-бірінен ажыратылады. Каллус ұлпаларды 3-4 апта өткеннен кейін, коректік ортадан шығарып алады да, бірнеше бөлікке бөліп, басқа жаңадан дайындалған қоректік ортаға отырғызылады, себебі қоректік ортаның күші әлсірейді, ұлпаның қоректенуі және ұлпаның ішкі бөліктерінің аэрациялануы төмендейді. Жаңа қоректік ортаның құрамы эксперименттің мақсатына байланысты болады, Егер каллустың бір қалыпты өсуін ұстап (сақтау) отыру керек болса, онда бастапқы қоректік орта құрамы өзгермейді.
Кейбір тәжірибелерде жасушалардың бір-біріне тигізетін әсерін ескере отырып, каллустарды өсірудің арнайы әдістері қолданылады. Қоректік ортада өсіру әдісінің бірі " бағушы" немесе " асыраушы қабат" , яғни бір каллус өсу үшін өсіру әдісінің бірі - екінші бір каллус ынталандырушы ретінде қолданылады. Бұндай жағдайда ұлпаны қоректік орта сіңген фильтр қағазына салады да, есімдіктің сол түрінің жаксы өсіп тұрған каллус массасына отырғызады. Кейде бір ыдыстың ішінде әр түрлі өсімдіктердің ұлпаларын өсіруге болады. Кейбір жағдайларда ұлпаларды бір-біріне немесе мүшелерді ұлпаларға телуді қолданады. Жақсы өсіп тұрған ұлпалар мен мүшелерден бөлініп шыққан кейбір заттар, тәжірибеге алынған каллустың өсуін жылдамдатады.
Организм құрылысын жасайтын элементтердің жаңадан түзілуіне байланысты организмнің дене көлемі мен массасының қайтымсыз үлкейуі өсу деп аталады. Жасушаның, құрылымдық элементтері: органеллалар, мембраналар, макромолекулалар және метаболиттер,ұлпаны құрайтын-жасушалар,ал мүшелер-олардың құрамына кіретін әр түрлі ұлпалар типтерінен тұрады.Сонымен,өсу дегеніміз сандық жағынан тірі компоненттердің молекуладан организмге дейін көбейу процессі /молекулалар-жасушалар-ұлпалар-мүшелер-организмдер/.
Өсімдіктің өсуі жасушалардың, ұлпалардың және мүшелердің өсуінен тұрады. Солай бола тұрса да, қандай да болсын өсудің негізі жасушадан басталады. Жасушаның өсуі бірінен соң бірі кезекпен келіп тұратын процесстерден тұрады: жасушаның бөлінуі, протоплазманың өсуі, созылуы және дифференциялануы. Өсу процестері негізінен меристемада жүреді.
Меристемалар жылдам бөлінетін жасушалары бар түзуші ұлпа. Жасуша бөлінуінің көбірек кездесетін жолы митоз, ол төрт стадиядан тұрады: профаза, метафаза, анафаза, телофаза. Жасуша бөлінер алдында оның компоненттері екі еселенеді. Жасушаның бөліну циклінің, анық ең қолайлы маркері ол ДНҚ - ның мөлшері. Әрбір екі митоз аралығында ДНҚ - ның екі еселенуі /репликациясы/ жүреді. Жасуша циклінің түрлі фазалары мынадай символдармен белгіленеді, М, Оі , С2 және 8 фазасы.
Жасуша циклінің М фазасы ядроның бөлінуі /митоз/ және цитоплазманың (цитокинез) бөлінуінен тұрады, осы фазадан кейін, жаңадан түзілген жасушалар жаңа жасушалық циклдің интерфазасына өтеді. Интерфаза О1 фазасынан басталады
Митоз кезінде төмендеген биосинтездік процесстер бұл кезде қарқынды түрде жаңадан басталады.Циклдің 3-фазасы ДНҚ-ы синтезделетін кезең, ядродағы ДНҚ-ы екі еселенгенде хромосомалар түгел репликацияланады /әрбір хромосома екі тең хроматидтермен тұрады/. Одан кейін жасуша С фазасына өтеді,бұл кезде жасуша бөлінуге дайындалады. М фазасы митоздан басталады да /атының шығуы осыған байланысты/ цитокинезбен аяқталады. М фазасының басталуы кезеңінде екі еселенген хромосомалар, енді тығызданып жарықтық микроскоптан көрінетіндей болады. Ядро қабығы бұзылады да хромосомалар ретті түрде орналасып жеке хроматидтерге жіктеледі. Жасушаның полюстерінде орныққан хромосомалардың сыртынан ядролық кабық пайда болады, жана ядролардың кайта құрылуымен қатар цитоплазма бөлінеді,бір ядросы бар екі жаңа жасуша түзіледі М фазасы цитокинез процессімен аяқталады да, келесі жасушалық циклдің интерфазасы қайта басталады.
Кейбір жас жасушалар митоздан кейін созылу фазасына ауысады.Созылу өзіне суды сіңіру аркылы жүреді,сонымен қатар бұл кезде белоктар нуклеин қышқылдары, көмірсулар, майлар және басқа заттар жаңадан түзіледі. Жаңадан бөлінген эмбриондық жасушаның жасуша қабығы және цитоплазма компоненттері түзіле бастайды. Жасушаның созылуы аяқталғаннан кейін келесі кезеңге дифференциялану яғни мамандану жағдайға ауысады.
Сонымен,жасуша бөлінгеннен кейін, әрбір жас жасушаның алдында үш мүмкіндік болады. 1/Эмбриондық жағдайда қалып, жасуша цикліне түсіп, митоз арқылы қайта бөліне алады. 2/Циклден тыс қалып, /О0/бөлінбей, тыныштық кезеңіне өтеді. З/Компетенцияға иеленіп жаңа бағыты біртіндеп айқындалып одан кейін ерекшелену /дифференциялану/ жолына түседі.
Компетенция- жасушалардың, ұлпалардың, мүшелердің, организмнің индукторлық әсерді қабылдап алуға кабілеттігі және әсер еткен факторға жауап ретінде өзінің даму бағытын өзгертуі.
Өзгерістерді әр түрлі факторлар туғызуы мүмкін. Мысалы: гормондар,көрші жасушалардың немесе басқа ұлпалардың, метаболиттері, электрофизиологишшқ сигналдар және т.б.
Жасушаның белгілі бір тұқым куалауды жүзеге асыруға әзір тұру қалпына тусуі-детерминация деп аталады. Қабілеттілігі бар жасушалық детерминациялануы оның дамуының белгілі бір жолын калыптастырады да,жетілудің басқа бағыттарда жүруін тежейді.Қабілетті жасушаның детерминациялануы жасуша бөлшегінен кейін бірден басталуы мүмкін яғни протоплазманың өсуі алдында. Белгілі бір ретаен детерминацияланған жасуша өте бір тар мамандыққа ие болады яғни дифференцияланады (қандай да бір ұлпаның жасушаларына айналады).
Дифференциация - жас жасушалар арасындағы құрылысы мен кызметі жағынан болатын өзгерістерді,аналық жасушалары мен жаңа пайда болған жасушалар арасында айырмашылықтарды тудыратын күрделі процесс. Дифференциялану (дифференцировка) - жасушаның маманданған жағдайы, басқа жасушалардан ерекшеленуі. Дифференциялану деген түсінік ол эмбриондық жасушаның маманданған жасушаға айналуы дегенді білдіреді.
Меристемалық жасушалар атқаратын қызметі және құрылысы жағынан біркелкі, дифференциялану нәтижесінде әр жолдармен дами бастайды да,түрлі мүшелердің ұлпаларын түзеді. Жасушаның қандай да бір даму жолына тусуі, синтезделуі гендер аркылы басқарылатын белгілар құрамымен анықталады.
ДНҚ-ы молекуласында шифрленген генетикалық информацияның іске асуы арнайы и-РНҚ түзілуі /транскрипция/ арқылы және одан кейін генетикалық кодына сәйкес белоктар синтезі /трансляция/ арқылы жүретіні белгілі. Бірақ, барлық генетикалық информация бір уақытта іске аспайды, жасушаның өсу және дифференциялану процесстері кезінде қатаң тәртіппен кезектесіп көрініп отырады. Геномдағы гендердің бір тобы бір кезеңде активті болады, яғни иРНҚ-ның мағыналы өнімі бар, ал келесі бір тобы активтілігін көрсете алмайды, себебі, ондай гендер активтілігі репрессор әсерінен тежелген. Сондықтан, жасушалар арасындағы айырмашылықтар, яғни олардың дифференциаялануы гендердің әр түрлі дифференциалды/ активтенуіне байланысты.
Жасуша құрамындағы белоктар фенотипті және жасушаның қызметін анықтайды. Жасуша қасиетін, құрылыстарын транскрипция процессі кезінде иРНҚ-ы анықтайтын ферменттер мен басқа да белоктардың әсеріне байланысты болады. Бұл жағдай 2 суретте анық көрсетілген.
Жасуша ерекшеленіп маманданған жасушаға айналғанда, /дифференцияланғанда/ оның құрылысы және онда жүретін зат алмасу да өзгереді, ал гендер жиынтығы организмнің барлық даму кезеңінде өзгермей бір қалыпты болады. Жасушада жүретін өзгерістер тек гендер активтілігіне байланысты. Бүл жағдайдан жасуша ерекшеленген маманданған жасушаға айналуын /дифферанциялануын/ түсіну үшін, негізгі мәселені анықтауымыз қажет; неге бір типті жасушаларда гендердің бір бөлігі активті, ал басқа типті жасушаларда басқа гендер ахтивті.
Гендер активтілігінің реттелуі мынадай алты деңгейде жүруі мүмкін:
1/ ДНҚ-ы синтезделуі /редукцикация/ деңгейінде: 2/ РНҚ-ы синтезделуі /транскрипция/ деңгейінде: 3/ продессинг деңгейінде:
4/ и РНҚ~ның ядродан цитоплазмаға тасымалдану деңгейінде:
5/ рибосомалардағы трансляция деңгейінде:
6/ цитоплазмада иРНҚ-ның кері кету деңгейінде.
Гендер активтілігінің ДНҚ синтезі деңгейінде реттелуі гендер репликациясының бір қалыпты жүруін бұзуы мүмкін, сондықтан әр түрлі жасушалардағы гендер жинағы да бірдей болмайды. Сонымен бірге гендер активтігі ДНҚ-ның күйі өзгеруіне де тәуелді. Гендер активтілігіне әсер ететін, ДНҚ-ның тұрақты өзгерістерінің үш типі белгілі. Біріншіден, хромосомадағы гендердің өзара орналасу ретінің өзгеруі, олардың атқаратын қызметіне әсер етуі мүмкін. Транслокация немесе инверсия кезінде ген орын алмастырып ДНҚ-ның басқа бөлігі арасына орналасады. Бұл жағдайда ген активтілігінің төмендеуіне немесе өте жоғары деңгейде көрінуіне әкеліп соғады. Гендердің орын алмастыру құбылысын, яғни жылжымалы генетикалық элементтерді алғаш рет Барбара Мак-Юшнток 1947 жылы ашқан. Кейінгі кезде белгілі болғандай транспозондар немесе жылжымалы генетикалық элементтер бір хромосомадан басқа хромосомаға орын ауыстыра алады, осыған байланысты гендердің жоғары дәрежеде мутациалануын жүргізеді немесе бұрын активтілігі жойылған гендердің активтілігін арттыра алады. Екіншіден, геномдағы қандай да бір геннің санының көбеюі де /амплификация/ геннің іске асу дәрежесіне /экспрессиясына/ әсер етеді. Өте жиі амплификацияға ұшырайтын рРНҚ- ның гендері. Геномдағы бір гендердің көбеюінің /амплификациясының/ жасушаның ерекшелініп маманданған жасушаға айналуындағы /дифференциялануындағы/ рөлінің қаншалықты маңызы бар екендігі өлі белгісіз. Үшіншіден, ген кұрылысының сапалық жағынан (мутация, делеция) өзгеруі мүмкін.
Прокариоттардағы транскрипция деңгейіндегі белок синтезінің реттелуін Жакоб және Моно жасаған оперон (бір репрессордың бақылауындағы гендер тобы) моделі жеткілікті дәрежеде түсіндіріп береді. Эукариоттар гендерінің активтілігінің реттелуін зерттеуше қиын, себебі, геномы күрделі және көлемі үлкен. Эукариот гендерінің дифференциялды активтілігі транскрипция денгейінде геномның белгілі бөліктерінің ашылу немесе көріну жолымен реттелуі мүмкін, яғни матрицадан информация алудың мүмкіншілігі өзгеруі арқылы.
Жоғарғы сатыдағы организмдер гендерінің реттелуі туралы гипотезаны Бритген мен Дэвидсон жасаған. Олардың болжауы бойынша гендердің экспрессиясының реттелуі ядрода алғашқы иРНҚ-ның кайсысы сақталып қалып, процессингке ұшырап, кейін цитоплазмаға өтетіні анықталған кезінде жүреді.
Цитоплазмаға өткен и РНК-ның трансляциясы бірден жүрмейді. Эукариоттардың эволюция барысында қол жеткізген жетістіктерінің бірі информосомалар. Информосомлар белок синтезінің реттелуін қамтамасыз етеді. Гендер экспрессиясының реттелуінің тағы бір кезеңі, ол трансляция процессі. Бірақ трансляция деңгейінде реттелу механизмдері туралы деректер жоқ деуге болады.
Сонымен, өсімдіктерде жүретін дифференциялану процессі өсімдіктердің қандай да бір бөліктерінің немесе тіршілік циклінің кез келген стадиясында өтетін гендер экспрессиясының айырмашылықтары арқылы анықталады.
Морфогенез дегеніміз пішін /форма/ құру процессі, яғни өсімдік мүшелерінің бастапқы элементтерінің құрылуы, өсуі және өнуі /органогенез/, ұлпалардың /гистогенез/ жөне өсімдік жасушаларының жетілуі /цитогенез/ немесе жасушаның дифференциялануы. Сөйтіп, морфогенез көп кезеңдерден тұратын күрделі процесс.
Организмнің дамуы - өсу, дифференциалануы, морфогенез процесстерінің бір - бірімен тығыз байланыста жүруінің нәтижесінде болады. Бүтін организмде бүл процесстерді бір - бірінен ажыратып қарау өте қиын. Сонымен қатар, бұл процесстер бір - біріне мүлде ұқсамайды, әрқайсысының өзіндік ерекшеліктері бар. Сол себепті, морфогенез процессін түсіну үшін оны өсу мен дифференциациядан бөлек алып қарау қажет. Сонымен қатар, морфогенез өсу мен дифференциациясының арқасында жүретінін естен шығармау қажет. Атап айтқанда сандық өзгеріс және сапалық жағынан қайта құрылудың нәтижесінде кеңістікте құрылысы және формасы бар құрылым пайда болады, яғни морфогенез процессі жүреді.
К. Уоддингонның анықтамасы бойынша, "Морфогенез дегеніміз - гомегендік, яғни жеке бөліктерден тұрмайтын массасының белгілі бір құрылымға айналуы". Тұтас организмде әр түрлі бөліктердің бір - біріне тигізетін әсерін камтамасыз ететін, көптеген корреляциялар, байланыстар болғандықтан, бұндай жүйеде морфогенездің көрінуін зерттеу өте қиын шаруа .
Морфогенезді зерттеудің өте қолайлы моделі, ол ұлпаларды, жасушаларды және протопласттарды жасанды қоректік ортада өсіру. Моделді қолданып жүргізген зерттеулердің артықшылығын, ол өсірілетін жасушаларға бір бағытта әсер ету арқылы, зерттеуші түрлі факторлардың әсерін бақылай алады.
