тарау бойынша бақылау сұрақтары

8. ПРОТОПЛАСТАРДЫ БӨЛІП АЛУ 
 
Клеткалық 
инженерия 
- 
өсіру, 
будандастыру 
және 
реконструкциялау негізінде жаңа типті клеткалар алу әдісі. 
Гибридизациялау кезінде екі клетканы жасанды жағдайда қосады, 
нәтижесінде будан геномы түзіледі. Бұл әдістің негізінде 
будандастыру үшін ата-аналық жыныс клеткалары (гаметалар) смес. 
өсімдік денесінің клеткаларынан (сомалар) бөлініп алынған 
протопластарды пайдалану жатыр. 
Оқшауланған (бөліп алынған) протопласт механикалық жолмен 
немесе 
ферментативтік 
мацерация 
көмегімен 
клеткалық 
қабықшасынан арылған клетка болып табылады, яғни протопласт - 
«жалаңаш клстка». Өсімдік протопластарын бүтін өсімдіктерді 
генетикалык модификациялауда пайдаланылатын көптеген әдістердін 
бастапқы объектісі деп қарастыруға болады. Клетка қабықшалары 
болмағандықтан өсімдіктің бір түрінің протопластарын оның екінші 
түрінің протопластарымен қосу арқылы жаңа будан есімдіктерін алуға 
болады. Протопластардың біріне-бірінің құйылуы арқылы қосылуы 
және онан бүтін өсімдіктің регенерациялануының негізінде 
парасексуалдық (жыныссыз) немесе соматикалық будандастыру 
жатыр. 
Протопластарды бөліп алудағы бастапқы материал ретінде 
өсімдіктің әртүрлі бөліктерін пайдалануға болады: жапырақтарын, 
тамырын, тұқымжарнағын, тамыр мойнын (гипокотиль), тозаң 
дәндерін, сонымен қатар каллустарды. Мұндай жұмыстарды 
орындаудағы негізгі талап - стерильділікті сақтау. Сондықтан 
асептикалық жағдай өсімдік мүшелерінен протопластарды бөліп алу 
және өсіру жұмыстарын барынша жеңілдетеді. 
Клетка қабықшасы, негізінен целлюлозадан, гемицеллюлоза 
және пектинді заттардан тұрады. Сондықтан оларды бұзу үшін 
құрамында целлюлаза, гемицеллюлаза және пектиназалары бар 
ферментік қоспалар пайдаланылады. 
Ферменттік ерітінділерді тәжірибе жұмысы жасалатын күні 
немесе онан бір күн бұрын дайындайды. Ерітіндідегі қоспалардан 
арылу үшін оны 2000 айналым/мин жылдамдықта 10-15 минут 
центрифугалайды. Центрифугаттың рН-ын қажетті мәніне дейін 
жеткізіп, ерітіндіні шприц көмегімен мембраналық сүзгі («Milliporе» 
фирмасы) арқылы өткізеді. Ферментативтік мацерация үшін жас 

жапырақтар пайдаланылады. Ферменттік ерітіндіні стерильді Петри 
тостағаншасына құяды. Өсімдік жапырағын стерильдеп, стерилді 
скальпелмен немесе ұстарамен онан ені 1 мм-дей болатын кесінді 
дайындап, ферменттік срітіндіге салады. Массасы, шашамен 1 г 
жапырақтың бөлігін, 10 мл фермент срітіндісінде 28-30°С 
температурада 15-18 сагат мацерациялайды. 
Егер протопластарды суспензиялардан алу керек болса, онда 
оларды алдын-ала центрифугалау арқылы тұнбаға түсіреді немесе 
сүзгіден өткізеді. Осыдан кейін протопластарды мацерациялаушы 
ерітіндіге салады (мынадай пропорцияда: 2 г протопласт : 10 мл 
мацерациялаушы ферменттік ерітінді). Қатты қоректік ортада 
өсірілген каллус ұлпаларын, скальпель немесе шпатель көмегімен, 
ферменттік қоспа құйылған ыдысқа салады. Ферментацияның 
ұзақтығы 
ұлпаның 
консистенциясына, 
ферменттердің 
концентрациясы 
мен 
комбинациясына, 
температура 
мен 
инкубацияның ұзақтығына байланысты. Сондықтан мацерация 
процедурасын инвертирленген микроскопты пайдалана отырып, жай 
көзбен бақылаған дұрыс. Сол үшін ферментация процесін колбада 
емес, Петри тостағаншасында жүргізген ыңғайлы. 
Ферменттер 
коспасында 
инкубацияланған 
материалды 
(протопластарды) нейлон сүзгісі арқылы көлемі кішпрек стерильді 
колбаға сүзеді. Жапырақ ұлпасының қалдықтары сүзгінің бетінде 
қалып қояды, ал протопластар колбаның ішінде болады. Осындай 
жолмен алынған протопластар суспензиясын стерильді центрифуга 
пробиркаларына құяды да, 1000 айналым/мин жылдамдықта 3 минут 
центрифугалайды. Тіршілікке қабілетті протопластар сұйықтың бетіне 
қалғып шығады. Оларды пипеткаға сорып алады да, жууға арналған 
сұйық құйылған ыдысқа құяды (сұйық құрамы қосымшада 
келтірілген). Сонан кейін протопластарды тұнбаға түсіру және 
ферменттік ерітіндіден арылу үшін, бұл ортаны 700 айналым/минут 
жылдамдықта 1-2 минут центрифугалайды. Осы процедураны екі рет 
қайталайды. 
Жуылып тазартылған протопластарды қоректің ортаның аздаған 
көлемінде (0,5 мл) ресуспензиялайды. 

жүктеу/скачать 4,52 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: