Өсімдік ұлпаларын өсіру және биотехнология бойынша зертханалық
жүктеу/скачать 4,52 Mb. Pdf көрінісі
|
|
8.1. Зертханалық жұмыстар № 1 жұмыс. Қазтамақ (герань) жапырақтарынан протопластарды бөліп алу Қажетті материалдар мен аспаптар: Қазтамақтың жапырақтары. 5%-тік кальций гипохлориті; ПШО 13M жәнс ПШО 21C орталары (қосымшаны қара); 1,5%-тік мейцелаза ерітіндісі; 0,05%-тік мацерозим R10 ерітіндісі. Центрифуга; микроскоп; Горяев немесе Фукс-Розенталь камерасы; пипеткалар; нейлон елеуіші (сито); диаметрі 140 мм болатын Пстри тостағаншалары; цснтрифуга пробиркалары. Жұмыстың орындалу тәртібі: 1. 30 өсімдіктің толық ашылған жапырағын сағағымен қоса таңдап алады. 2. Жапырақтарды 5%-тік кальций гипохлориті ерітінждісінде 30 мин ұстайды. 3. Стерильді пинцет көмегімен жапырақтарды кюветаға салып, стерильді дистильденген сумен 6 рет шаяды. 4. Жапырақтың төменгі шетін кесіп, төменгі эпидермисін алып тастайды да, ұзындығы 2 см болатын сегменттерге бөледі. 5. Сегменттерді 30 мл ПШО 13М ортасы құйылған Петри тостағаншасына (диамстрі 140 мм) салады (плазмолиз үшін) Жапырақ бөліктері тостағаншадағы ерітіндінің бетін толық жауып жатуы керек. 6. Пипетка көмегімен ПШО 13М ерітіндісін алып тастап, оның орнына 25 мл фермент ерітіндісін құяды. Оның құрамы: 1,5%- тік мейцелаза, 0,05%-тік мацерозим R10. ортаның рН - 5,8. Жапырақ бөліктерін араластырмай, ерітіндіде 12-14 сағат бойы 27°С температурада инкубациялайды. 7. Ерітіндідегі протопластарды жапырақтардың сегменттерінен бөліп алу үшін жапырақ сегменттері бар инкубациялық қоспаны нейлон сүзгісі арқылы өткізіп, онан өткен сұйықты 25 мл ПШО 21С ортасы құйылған Петри тостағаншасына құяды. 8. Протопластар суспензиясын фермент ерітіндісінен бөліп алады. Ол үшін пипетка көмегімен суспензияны центрифуга пробиркасына құйып, оны 100 g жылдамдықта 3-5 мин центрифугалайды. 9. Тазартылған тұнбаға 10 мл ПШО 13М ортасын косып, микроскопта қарайды. 10.Горяев немесе Фукс-Розенталь камерасында протопластар санын есептейді. Ол үшін камераның үстіңгі және астыңғы сеткаларына бір тамшыдан суспензияны тамызады да, жабын шынысымен жабады. Ньютон сакинасы пайда болғанша, шынының үстін шетіне қайрай жайлап, саусақпен сипайды. 11.1 мл сұйықтағы протопластардың санын мына формула бойынша есептейді: мұнда, А - үлкен квадраттағы протопластар саны, В - үлкен квадраттардың саны. 1 мл ортадағы протопластардың саны 5 10 -нан 1 10° болса протопластардың тығыздығы оптимальды болып саналады. жүктеу/скачать 4,52 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|