Фармацевтическая

392
а
б
Рис. 351.
Хроматографическая колонка обращённо-фазная в работе: 
а
— вид помещённой хроматографической колонки в инжектор; 
б
— хроматографическая колонка Phenomenex. 
На 21-й минуте хроматографирования появляется пик кислоты сорбино-
вой (рис. 352) в программе «Мультихром». 
Рис. 352.
Пик сорбиновой кислоты на 21-й минуте в программе «Мультихром» 
За пиком кислоты сорбиновой сразу выйдет пик кислоты бензойной (рис. 
353); 
382

393
Рис. 353.
Два хроматографических пика кислот бензойной и сорбиновой 
в программе «Мультихром» 
8) увеличиваем масштаб хроматограммы с двумя пиками двух кислот, 
проводим разметку (рис. 354). Устанавливаем вертикальные реперные линии на 
точке слияния основания хроматограммы и базовой линии по кислоте сорбино-
вой на правой точке слияния с базовой линией; 
Рис. 354.
Разметка хроматограммы кислот сорбиновой и бензойной 
первого калибровочного раствора с самыми низкими концентрациями стандартов 
по правому слиянию в программе «Мультихром» 
383

394
9) перемещаем реперную вертикальную линию либо на место слияния 
пика с базовой линией, либо на перегибе кривой справа. Оба варианта возмож-
ны. Однако надо запомнить, где поставлена реперная линия, так как на протя-
жении всего анализа и при анализе образцов реперную линию надо будет ста-
вить везде одинаково (рис. 355). Закрепляем перемещение; 
а
 
б
 
Рис. 355.
Перемещение вертикальной реперной линии справа на точку слияния 
хроматограммы с базовой линией (
а
) 
и её закрепление в программе «Мультихром» (
б
) 
384

395
10) выходим из режима разметки хроматограммы. Сохраняем все измене-
ния в шаблоне хроматограммы (рис. 356); 
Рис. 356.
Сохранение итоговой разметки по первому калибровочному раствору 
стандартных веществ с наименьшими концентрациями в программе «Мультихром» 
11) описываем параметры пиков. Пик № 1 — кислота бензойная, пик 
№ 2 — кислота сорбиновая. Очень важный показатель 5% уровень значимости 
(рис. 357). Для ВЭЖХ наиболее часто применеют 3% значимости; 
Рис. 357.
Описание параметров хроматографических пиков кислот бензойной 
и сорбиновой в программе «Мультихром» 
12) вводим значения концентрации для каждого из стандартных веществ 
с целью получения точки на графике и её фиксации (рис. 358). Для первой ка-
либровочной точки для каждого из веществ концентрация составляет по 
50 мг/мл; 
385

396
Рис. 358.
Введение значений концентраций в мг/мл для каждого 
из стандартных веществ в программе «Мультихром» 
13) перезагружаем метод. Указываем, что это будет точка № 2 (рис. 359) 
для следующего раствора стандартных веществ бензойной и сорбиновой ки-
слот. 
Рис. 359.
Диалоговое окно по точке № 2 для второго раствора стандартных веществ 
с концентрациями 100 мг/мл каждого из веществ в программе «Мультихром» 
После разделения элюент с пробой попадает в спектрофотометрический 
детектор. Данный детектор может работать в двух диапазонах длин волн — 
ультрафиолетовый диапазон и видимый диапазон. Граница между ними — 
длина волны 375 нм. При данной задаче детекция вещества осуществляется при 
длине волны 230 нм. Это компромиссная длина волны. Если бы мы детектиро-
386

397
вали только лишь кислоту сорбиновую, можно было бы установить длину вол-
ны 254 нм. Можно работать и при 200 нм — жёсткий вакуумный ультрафиолет. 
Но тогда надо использовать азот в газовом состоянии для продувки камеры мо-
нохроматора. Источником получения ультрафиолета в детекторе является дей-
териевая лампа. В данном хроматографе «Стайер» («Аквилон», Россия) есть 
магистраль для подачи азота. 
В дальнейшем повторяем этот же ход анализа для остальных калибровоч-
ных растворов, содержащих стандарты кислот бензойной и сорбиновой для 
концентраций 100, 150, 200 мг/мл. При градуировке надо проводить два парал-
лельных измерения. Следовательно, по четырем градуировочным растворам те-
буется проводить ещё 2 параллельных измерения. Итого 12 градуировочных 
измерений. Все показатели градуировки остаются в памяти программы в виде 
файлов. Каждая отдельная методика анализа прописывает частоту проведения 
градуировки. Обычно градуировка проводится один раз в квартал. 
В процессе рисования хроматограммы вкалываем следующий калибро-
вочный раствор повышающей концентрации, содержащий стандарты кислоты 
сорбиновой и кислоты бензойной. Но лучше, если мы анализируем калия сор-
бат и натрия бензоат, использовать стандарты именно этих солей; 
14) необязательный этап — дегазация анализируемого раствора, так как у 
нас анализу на консерванты подвергается газированный напиток (рис. 360). Де-
газация газированного напитка осуществляется, например, путём пропускания 
его через фильтр из шприца (по типу вакуумной дегазации). 
Рис. 360.
Дегазация анализируемого раствора — газированного напитка 
Газированный напиток предварительно можно не очищать от колера, так 
как красители останутся на фильтре предколонки. Предколонка используется 
для предварительной очистки от балластных веществ и иных соединений, ме-
шающих проведению хроматографического анализа; 
15) вкол пробы (раствора анализируемого вещества, объекта исследова-
ния). Хроматографический шприц несколько раз промываем водой очищенной 
387

398
и очищаем от остатков калибровочных растворов. Затем от остатков калибро-
вочных растворов также промываем петлю. В режиме загрузки осуществляют 
несколько вколов шприцем с водой очищенной в инжектор. При этом кран ин-
жектора повёрнут влево до упора. После промывки водой очищенной шприцем 
несколько раз вводим анализируемый раствор; 
16) когда все калибровочные растворы отхроматографированы, мы мо-
жем посмотреть график. На графике все точки должны лежать, в идеале, на од-
ной прямой линии или касаться её. Это означает, что приготовления калибро-
вочных растворов с заданными концентрациями веществ прошли точно, а про-
цедура хроматографии — успешно и выдержаны все условиях хроматографи-
рования по данной методике. При этом коэффициент корреляции (
r
) должен 
быть не ниже 0,999 (рис. 361); 
Рис. 361.
Калибровочная прямая (линейная зависимость) по растворам 
стандарта кислоты бензойной 
17) хроматография анализируемого раствора с автоматическим подсчётом 
содержания веществ в напитке. 
Резюмируя ход анализа ВЭЖХ, необходимо вкратце выделить основные 
этапы хроматографирования, а именно: 
1) запись хроматограмм растворов стандартных веществ по анализируе-
мому образцу. При необходимости для кажого раствора стандартного вещества 
записываем два параллельных измерения. И по функции усреднения получаем 
средние значения концентраций по каждому раствору стандартного вещества. 
Начинается хроматография от менее концентрированных растворов к более 
концентрированным; 
2) все хроматограммы записываются в метод анализа. Данный метод соз-
дается на основании предыдущего метода, более близкого к данному по пара-
метру редактирования. Сохранение метода; 
388

399
3) анализ пробы. Открываем метод. Вводим пробу. И как в паспорте на 
хроматограф указываем, что в данный момент записывается точка не калибро-
вочного раствора, а вводится проба. Хроматографирование пробы. Получаем 
результат. 
3.4.2. СТАНДАРТНАЯ ОПЕРАЦИОННАЯ ПРОЦЕДУРА 
ПРИ РАБОТЕ НА КОМПЛЕКСЕ 
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ 
При работе на комплексе ВЭЖХ выделяют несколько типов СОП в зави-
симости от этапов анализа. Ниже перечислены и раскрыты примеры СОП по 
данным сайта https://www.pharmaguideline.com. Перевод с английского языка 
осуществлён автором учебно-методического пособия. 
СОП на получение, проверку и регенерацию колонки для ВЭЖХ 
1. Цель: изложение порядка проверки работоспособности колонки для 
ВЭЖХ на основании данных сертификата хроматографической колонки, полу-
ченной от поставщика, и осуществление теста на производительность. Также 
описание регенерации хроматографической колонки. 
2. Область применения: процедура применима ко всем типам обращённо-
фазных колонок (С8, С18, циано-, фенил-) и нормально-фазных колонок (Si). 
3. Ответственность. 
3.1. Выполнение: технический помощник, руководитель. 
3.2. Проверка: менеджер анализа. 
4. Подотчётность: начальник отдела. 
5. Процедура. 
5.1. Проверка новой колонки ВЭЖХ. 
5.1.1. При получении новой хроматографической колонки от по-
ставщика подготовить колонку с использованием метанола со скоро-
стью 0,5 мл/мин. 
5.1.2. Проверить хроматографическую колонку на выдерживание 
давления, времени удерживания, теоретических тарелок с использова-
нием материалов в соответствии с сертификатом анализа. Записать ре-
зультаты. 
5.1.3. Выполнить процедуру анализа хроматографической колон-
ки на выдерживание давления, времени удержания, числа теоретиче-
ских тарелок. Записать результаты. 
5.1.4. Проверка высокоэффективной обратно-фазной колонки. 
Подвижная фаза метанол : вода очищенная (70:30) по объёмам. 
Скорость потока подвижной фазы 1 мл/мин. 
Длина волны 254 нм. 
Объём вкола 20 мкл. 
Чуствительность 0,005 AUFS. 
389

400
Испытательный раствор (подвижная фаза) для обращённо-
фазных колонок (С8, С18) — смесь бензола и толуола 0,1%. 
Испытательный раствор (подвижная фаза) для обращённо-фаз-
ных колонок (циано-, фенил-) — смесь бензола 0,1% и нафталина объ-
ёмом 4 мл в 100 мл подвижной фазы. 
5.1.5. После проверки промыть хроматографическую колонку ме-
танолом в течение 20 мин при скорости потока подвижной фазы 
1 мл/мин в прямом направлении, и оставить метанол в хроматографи-
ческой колонке для её консервации. 
5.1.6. Проверка высокоэффективной нормально-фазной колонки. 
Подвижная фаза изопропанол : н-гексан (40:60). 
Скорость потока подвижной фазы 1 мл/мин. 
Длина волны 254 нм. 
Объём вкола 20 мкл. 
Чуствительность 0,005 AUFS. 
Испытательный раствор (подвижная фаза) — смесь толуола 
(0,5 мкл/мл) и диэтилфталата (2 мкл/мл). 
5.1.7. После проверки промыть хроматографическую колонку н-
гексаном в течение 20 мин при скорости потока подвижной фазы 
1 мл/мин и оставить н-гексан в хроматографической колонке для её 
консервации. 
5.2. Присвоение номера столбцу следующим образом: 
XXX YYY 
где XXX — это заголовок столбца 2–3 цифры, например колонка 
OPB = OPB. 
Амино-колонка = NH. 
Нормально-фазная колонка = Si. 
Колонка для разделения белков = PP. 
Высокий молекулярный вес белка = HMWP. 
YYY — серийный номер хроматографической колонки, напри-
мер начиная с серии 001. 
5.2.1 Записать данные хроматографической колонки. 
5.3. Регенерация высокоэффективной обращённо-фазной колонки. 
5.3.1. Промыть хроматографическую колонку тёплой водой очи-
щенной с температурой около 55°С со скоростью потока подвижной 
фазы 0,7 мл/мин в течение 10 мин. Поддерживать температуру колон-
ки при 55°С. 
5.3.2. Вколоть по 100 мкл димексида 4 раза с интервалом в 2 мин. 
5.3.3. Промыть метанолом со скоростью потока 0,7 мл/мин в об-
ратном направлении в течение 70 мин. 
5.3.4. После промывки метанолом промыть колонку хлорофор-
мом в течение 70 мин со скоростью потока 0,7 мл/мин в обратном 
направлении. 
5.3.5. В конце колонку промыть метанолом в течение 70 мин при 
расходе 0,7 мл/мин в обратном направлении. 
390

401
5.3.6. После регенерации колонки выполнить испытание колонки 
на производительность в соответствии с п. 5.1.4–5.1.5. 
5.3.7. Хранить хроматографическую колонку в метаноле после 
промывки метанолом в течение 20 мин при расходе 1 мл/мин в нор-
мальном направлении. 
5.3.8. Вести карту истории проверки хроматографических коло-
нок. 
5.4. Регенерация высокоэффективной нормально-фазной колонки. 
5.4.1. Промыть колонку н-гексаном в течение 60 мин при расходе 
2 мл/мин. 
5.4.2. После промывки н-гексаном промыть колонку хлористым 
метилом в течение 60 мин со скоростью потока 2 мл/мин. 
5.4.3. После промывки хлористым метилом промыть колонку 
изопропанолом в течение 60 мин со скоростью потока 2 мл/мин. 
5.4.4. В конце промыть колонку метанолом в течение 60 мин при 
расходе 2 мл/мин. 
5.4.5. После регенерации хроматографической колонки выпол-
нить проверку технических характеристик согласно п. 5.1.6–5.1.7. 
5.4.6. Хранить колонку в н-гексане после промывки н-гексаном в 
течение 20 мин со скоростью потока 2 мл/мин в нормальном направ-
лении. 
Проверка колонки и показатели регенерации. 
Хроматографические колонки. 
Дата поступления колонки (табл. 56). 
Серийный номер колонки. 
Дата выдачи колонки. 
Размер колонки. 
Проверка новой колонки (табл. 57). 
Таблица
 56 
Расчёт теоретических тарелок колонки 
№ 
п/п 
Компонент 
Данные согласно 
Наблюдаемые данные 
Тарелки 
Rt 
Тарелки 
Rt 
1 
2 
3 
Параметры поверки колонок представлены в таблице 57. 
Таблица
 57 
Поверка колонки 
Номер 
теоретической тарелки 
На выходе 
Разре-
шение 
Дата 
проверки 
колонки 
Давление 
Бензол-
толуол 
Толуол-
нафталин 
диэтилфталат
Бензол-
толуол 
Толуол-
нафталин 
диэтилфталат 
391

402
СОП по ВЭЖХ анализу и документированию процедуры 
1. Цель: описание процедуры ВЭЖХ анализа и документирование в обес-
печении надлежащей лабораторной практики в области ВЭЖХ анализа. 
2. Область применения: этот СОП применим для процедуры, которой 
нужно следовать в анализе и документировании ВЭЖХ анализа и обеспечении 
надлежащей лабораторной практики в области ВЭЖХ анализа. 
3. Ответственность: сотрудник или руководитель в области контроля ка-
чества. 
4. Подотчётность: менеджер по контролю качества. 
5. Процедура. 
5.1. Должна быть доступна последовательность для анализа перед за-
пуском прибора. 
5.2. Подвижная фаза. 
5.2.1. Подвижная фаза должна быть приготовлена в соответствии 
с составом, описанным в стандартной процедуре испытаний соответ-
ствующего образца. 
5.2.2. Контейнер с содержанием подвижной фазы должен иметь 
следующую маркировку: подвижная фаза, продукт, номер анализа, 
кем приготовлен, использовать до, дата, концентрация буфера, уро-
вень рН и т. д. В протокол анализа вносятся данные записи. 
5.2.3. Подвижная фаза не должна использоваться по истечении 
7 дней с даты её приготовления. 
5.2.4. Подвижная фаза уничтожается, если при визуальном ос-
мотре обнаруживаются какие-либо помутнения или осадки. 
5.3. Разделительный раствор (элюент). 
5.3.1. В случае, когда элюент, необходимый для подготовки сис-
темы, должен храниться в течение более длительного времени, ему 
должен быть назначен срок хранения, исходя из следующего: 
а) элюент необходим для параметра пригодности системы со-
гласно требованиям стандартной процедуры испытаний на каждую 
процедуру изучения; 
б) для основного анализируемого пика разница в подсчёте 
площади хроматографического пика не должна превышать 20% от 
лимита; 
с) для хроматографических пиков примесей разница в подсчёте 
между площадями пиков должна быть не более 20%. 
5.4. Подготовка стандарта. 
5.4.1. Подготовка стандарта будет осуществляться в соответствии 
с требованиями стандартной процедуры испытаний, принимая во 
внимание их требования к параметрам «стабильность» и «хранение». 
5.5. Анализ. 
5.5.1. Пригодность системы должна быть установлена в соответ-
ствии со стандартной процедурой испытаний, прежде чем начать про-
водить анализ. 
392

403
5.5.2. Последовательность впрыска должна регистрироваться в 
системе в соответствии со стандартной тестовой процедурой. 
5.5.3. Последовательность впрыска, которой необходимо следо-
вать, должна соответствовать стандартной тестовой процедуре. 
В качестве руководства может быть использована следующая после-
довательность впрыска: холостой опыт 
→
пригодность системы 
→
стандарт примеси (если необходимо) 
→
стандарт 
→
образец. 
5.5.4. Система должна быть пригодна в течение суток. Примерно 
через каждые 24 ч необходимо устанавливать пригодность системы. 
5.5.5. Для анализа проб и сопутствующих веществ, реагентов 
примерно через каждые 24 ч вводится стандартный раствор в трёх эк-
земплярах. 
5.6. Приёмочные критерии. 
5.6.1. Если впрыскиваемый раствор разрешён к применению, то 
он должен быть использован в течение рабочего дня. В противном 
случае раствор для впрыска должен быть свежеприготовленным. 
5.6.2. В тех случаях, когда требуется вводить образец дважды-
трижды, соотношение площадей пиков данных образцов между по-
следовательными впрысками должно лежать в пределах от 0,99 до 
1,01 от среднего значения площади. 
5.6.3. Отношение площадей между прерывистым введением об-
разцов также дожно лежать в пределах от 0,99 до 1,01 от среднего 
значения площади. 
5.6.4. Во время анализа вещества и реактивов в изократическом 
режиме скорость потока подвижной фазы должна быть практически 
постоянной в случае подтверждения пригодности системы. Если ско-
рость потока изменяется в течение 200 мин и более, пригодность но-
вой системы должна быть подтверждена. 
5.6.5. Во время анализа вещества и реактивов в градиентном ре-
жиме впрыскиваемый образец, в случае задержки впрыскивания, ана-
лиз в градиентном режиме должен быть продолжен. Хроматограмма 
холостого опыта должна быть записана. 
5.6.6. В случае превышения времени анализа данные о нём долж-
ны быть выявлены и проверены руководителем. Пригодность системы 
должна быть проверена перед вводом любых проб. 
5.7. Запись хроматограммы. 
5.7.1. Вся хроматограмма до установления пригодности системы 
должна быть записана и задокументирована. 
5.7.2. В случае, если хроматограмму необходимо игнорировать, 
аналитик должен данную хроматограмму показать руководителю для 
рассмотрения и одобрения. 
5.7.3. Неучтённая хроматограммам должна быть проверена су-
первайзером. 
5.7.4. Хроматограмма, которая признана непригодной, не учиты-
вается при расчётах и отмечена соответствующей подписью. Причины 
393

404
игнорирования хроматограммы: изменения количества зон, смещение 
базовой линии, «лишний» пик и др. 
5.7.5. Аналитик, проводящий анализ, должен указать причину от-
браковывания хроматограммы на самой хроматограмме. 
5.7.6. Параметры хроматограммы должны быть напечатаны на 
самой хроматограмме. 
5.7.7. Параметры интегрирования, такие как ширина пика, поро-
говое значение пика, минимальная площадь пика и высота пика, 
должны регистрироваться. 
5.7.8. При переснятии хроматограммы (при необходимости) дата 
и время должны быть задокументированы с указанием причины пере-
снятия хроматограммы. 
5.8. Подсчёт. 
5.8.1. Все подсчёты должны выполняться согласно соответст-
вующей стандартной тестовой процедуре и в соответствии с количе-
ством и значением площади хроматографических пиков, полученных 
сначала с введением стандартного образца. Подсчёт площади проме-
жуточного введения стандарта не учитывается. 
СОП по применению комплекса высокоэффективной жидкостной 
хроматографии на примере хроматографа компании Agilent 
1. Цель: установление порядка работы на комплексе ВЭЖХ с использова-
нием программного обеспечения Chemistation. 
2. Область применения: этот СОП применим к работе системы ВЭЖХ с 
использованием программного обеспечения Chemistation для системы ВЭЖХ 
Agilent. 
3. Ответственность: сотрудник или руководитель отдела контроля ка-
чества. 
4. Подотчётность: менеджер отдела контроля качества. 
5. Процедура. 
5.1. Работа на высокоэффективном жидкостном хроматографе. 
5.1.1. Убедиться, что комплекс ВЭЖХ установлен на ровной и 
чистой поверхности. 
5.1.2. Убедиться, что комплекс подключён к источнику питания. 
5.1.3. Убедиться, что все коммуникационные кабели между уст-
ройствами подключены правильно. 
5.1.4. Включить электропитание и нажать выключатели питания 
всех модулей. 
5.1.5. Подготовить подвижную фазу, как указано в СОП на кон-
кретный продукт. Поместить подвижную фазу в химическую бутыль 
для ВЭЖХ. Поместить в бутыль трубку и убедиться, что фильтр нахо-
дится ниже уровня подвижной фазы. 
5.1.6. Убедиться, что соответствующая смесь растворителей для 
промывки трубок откачана. 
394

405
5.1.7. Убедиться, что выпускная трубка из детектора погружена в 
бутыль для слива. 
5.1.8. Подсоединить хроматографическую колонку в отсек колон-
ки в направлении потока подвижной фазы, как отмечено на колонке. 
5.1.9. Включить компьютер. После завершения самодиагностики 
будет отображаться главное меню рабочей станции. 
5.1.10. Дважды щёлкнуть значок Chemistation на экране рабочего 
стола, чтобы открыть программу. 
5.1.11. Включить комплекс ВЭЖХ (инжектор, насос, термостат, 
колонку и ультрафиолетовую лампу), нажав кнопку «ON». Экран из-
менит цвет с красного на зелёный. 
5.1.12. Открыть продувочный клапан прибора и продуть соответ-
ствующим растворителем. Установить скорость потока насоса 
5 мл/мин, используя меню «Настройки насоса» на панели, пока систе-
ма не заполнится подвижной фазой. 
5.1.13. Убедиться, что в линии подачи растворителя нет пузырь-
ков воздуха. 
5.2. Методика. 
5.2.1. Нажать на папку «Метод» соответствующего инструмента 
и создать новый метод. 
5.2.2. Чтобы создать новый метод, нажать в меню файла метода, 
нажать «Новый метод», ввести комментарий для старого метода в 
отображаемом окне и нажать «ОК». 
5.2.3. Чтобы создать новый метод, нажать на меню файла, от-
крыть Edit entire method («Редактировать метод») и нажать «ОК». 
5.2.4. Ввести информацию о методе и нажать «ОК». 
5.2.5. В опции Set up injector («Настройка инжектора») введите 
объём впрыска согласно требованиям. Опция промывки иглы инъек-
цией осуществляется введением растворителя из пронумерованной 
виалы и нажать «ОК». 
5.2.6. В опции Set up pump («Настройка насоса») вводят значение 
расхода подвижной фазы в мл по двум типам (изократиче-
ский/градиентный), а для градиентного типа подачи подвижной фазы 
создаётся расписание программы для насоса в соответствии с требо-
ваниями испытаний. Вводят время остановки для образца и устанав-
ливают максимальное давление 400 фунтов на см
2
. Нажимают «ОК». 
5.2.7. В опции Column thermostat method («Метод термостата ко-
лонки») вводят требуемое значение температуры и нажать «ОК». За-
тем открывают опцию детализации сигнала и нажимают «ОК». От-
крывают опцию «Edit integration events» («Редактировать события ин-
теграции»). Нажимают «ОК». 
5.2.8. В опции VWD

жүктеу/скачать 66,35 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: