Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер
ДНҚ-ның рестрикциялық талдауы
жүктеу/скачать 5,04 Mb. Pdf көрінісі
|
| 4.4. ДНҚ-ның рестрикциялық талдауы
Рестрикциялайтын нуклеазалар немесе рестриктазалар – бұл ДНҚ- дағы белгілі бір нуклеотидтік тізбекті (рестрикция сайттарын) та- нитын жəне бұл сайттарда қос спиральді ыдырататын эндонуклеаза ферменттерінің тобы. Тіпті бактериялардың барлық түрі бір-бірден не- месе бірнешеден рестрикциялық эндонуклеаза типтерін синтездейді. Рестриктазалар бактериялық клеткалардың бөтен ДНҚ молекулала- рынан (ең алдымен ДНҚ бактериофагтарынан) қорғану үшін пайда болды, ал ол бактерия клеткасына енуі жəне оның трансформациясын туғызу мүмкін. Рестрикция ферменттерінің үш негізгі түрі төмендегідей сипатта- лады: 1. I түрдегі рестрикциялық эндонуклеазалар белгілі бір нуклеотид- тер тізбегін таниды жəне қос тізбекті ДНҚ молекуласын бұл тізбекке жақын қандай да бір арақашықтықтан кеседі; 2. II түрдегі рестриктазалар палиндромды тізбектерді (орталық симметриясы бар инвертирленген қайталамалар жəне екі жақтан бірдей оқылады) таниды. Олар ДНҚ молекулаларын рестрикция сайты ішінен немесе оған жақын аймақты кеседі; 3. III түрдегі эндонуклеазалар ДНҚ-ның белгілі бір тізбектерін та- ниды жəне қос спиральді оның соңынан белгілі бір негіз жұптарының санын баса отырып кеседі, бұл кезде рестрикция сайты ылғи да асим- метриялы болады. Алайда рестриктазалардың I түрі белгілі нуклеотидтер қатарын танығанымен, оны əрқилы нүктелерде үзеді, ал рестриктазалардың II жəне III типтері ДНҚ-ның нақты бөліктерін дəл үзе алады. Молекулалық биология мен генетикалық инженерия үшін қызығушылық тудыратыны II типті рестриктазалар болып табылады, себебі олар бірдей нуклеотид тізбектерінің фрагменттері бар ДНҚ пре- параттарын алуға жəне əртүрлі геномдардан алынған (мысалы, бакте- рия геномы мен өсімдік геномдарынан) фрагменттерден химерлі ДНҚ молекуласын құрастыруға мүмкіндік туғызады. Рестриктазалардың көмегімен молекулалық ДНҚ-да нақты фиксацияланған ыңғайлы маркерлерді орнатуға болады. Бұдан басқа, олардың өте үлкен мөлшері молекулаларды ұзындығы бірнеше мыңға дейінгі негіздік жұбы бар фрагменттер жиынтығына айналдыруға мүмкіндік береді. Электрофорез кезінде агароздық гельде мөлшері бойынша ажыратылатын ДНҚ бөлiктерін оңай бөліп алуға болады. 145 Əрбір рестрикция ферменттері үшін реакцияның оңтайлы жағдайы болады. Негізгі талап температура мен буфердің құрамына қойылады. Рестриктазалар үшін оңтайлы температура 37ºС құрайды. Белгілі бір молекулалық ДНҚ-да рестрикция сайттарының оқшау бөлiгi қатаң бекітілген жəне ерекшелігіне байланысты белгілі бір рестрикциялық эндонуклеаза ДНҚ-ның белгілі бір молекуласын гидролиздейді. ДНҚ бөлiктерінің талдауы негізінде рестрикциядан кейін геномның немесе геном фрагментінің рестрикциялық картасын құруға болады. Геномның рестрикциялық картасы (геном бөлiгінің) əртүрлі рестриктазалар үшін кескіндеуші сайттары енгізілетін геном- ды белгілеулері болады (4.3-сурет). Бұл сайттарды геномның функ- циональды элементтерімен қатар қоя отырып, ДНҚ-ның белгілі бір тізбегін қиып алуға болады немесе бір организмнің ДНҚ-сына басқа бір организмнің ДНҚ фрагменттерін енгізуге, орнатуға болады. Бұдан басқа, рестрикциялық карталар əртүрлі ДНҚ фрагменттерін салысты- ру үшін жəне сəйкестендіру үшін қолданылады. 4.3-сурет. рВR322 плазмидасына арналған ДНҚ-ның рестрикциялық картасы. Антибиотиктерге (тетрациклин мен ампициллинге) төзімділік гендері жəне əртүрлі рестриктазаларға (эндонуклеазаларға) арналған рестрикция сайттарының орындары белгіленген (Калашникова жəне басқалары, 2006) Жұмыс жасау барысы: Түтiкке 17 мкл бидистилденген суды құяды жəне тиісті рестриктазалар үшін 2 мкл 10 реттік буферді қосады. Ерітіндіні араластырады, яғни түтiкте саусақпен ұра отырып аралас- тырады. Үстіне 1 мкл талданатын ДНҚ-ны құяды (1 мкг/мл) жəне ара- 146 ластырады. 1-5 бірлік рестриктазаларды қосады. Жақсылап араласты- рады. Қоспаны 37ºС-де 1 сағат инкубациялайды. Реакцияны 4 мкл 0,5 М ЭДТА енгізу арқасында тоқтатады. Үлгіні енгізу үшін 3мкл буферді қосады. Үлгіні 0,8%-дық агароз геліне енгізеді де, ДНҚ фрагменттерінің электрофорезін жүргізеді. Сонымен қатар электрофорезге белгілі мөлшердегі фрагменттер мен ДНҚ маркерлерін енгізеді. Алынған ДНҚ бөлiктерінің мөлшерін талдайды, рестрикция сайттарының са- нын жəне олардың молекулалық ДНҚ қарым-қатынасында орналасуын анықтайды. Алынған рестрикциялық картасы ДНҚ рестрикция молекуласында əртүрлі рестриктазаларға арналған сайттардың орналасуын көрсетеді. Сонымен, фага λ негізінде векторларға құрастырылған 20 мың н.ж. ДНҚ-фрагменттері енеді, яғни плазмид вектормен салыстырғанда екі есе көбірек. Сондықтан фаг λ векторлары организмдердің үлкен өлшемі бар геномдарды клондау үшін ыңғайлы болады. Фагтардың бөлшектеріне хромосомдық ДНҚ-ны орау механизмінің тек ДНҚ-ның бір өлшемі бар фрагменттерді енгізу мүмкіндігі бар. Егер осы арақатынас сəйкес болмаса, векторлық молекулалар фагтарға оралмайды жəне олар клондан,айды. жүктеу/скачать 5,04 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|