Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер
Рестрикциялық ферменттер
жүктеу/скачать 5,04 Mb. Pdf көрінісі
|
| 4.3. Рестрикциялық ферменттер
Рекомбинантты ДНҚ технологиясының рестрикция қалыптасуы ерекше ферменттер тобы эндонуклеазалардың немесе рестрикта- залардың ашылуына жəне қолдануына байланысты. 1972 ж. В.Арбер бактерия клеткасынан рестрикция ферменттерін алды. Барлық бак- териялар қос тізбекті ДНҚ-ның белгілі нуклеотидтер бөлігін үзе алатын бір немесе бірнеше рестриктазаны синтездейді. Рестрикция ферменттерінің клеткадағы қызметі – бактерияға енген бөтен ДНҚ мо- лекуласынан қорғау, рестрикцияны тоқтату. Рестрикция ферменттері фагтың нуклеин қышқылын үзіп, оның бактериялық клеткада көбеюін тоқтатады. Рестрикция ферменттерін синтездейтін клетканың ДНҚ молекула- сы эндонуклеазалардың əсерінен үзілмейді, өйткені бұл клеткалар мо- дификациялау ферменттерін синтездейді, олардың əсерінен ДНҚ-ның құрылымы модификацияланады (жаңарады). ДНҚ-ның репликациясы кезінде рестриктаза танитын бөліктерге метил тобын (СН 3 ) жалғайды. Метилденген ДНҚ-ны рестриктаза үзе алмайды. Мұны бактериялардың өзіндік бір иммундық жүйесі деп санауға болады. Дегенмен кейде бак- терия клеткасына енген кейбір бактериофагтардың нуклеин қышқылы метилденіп кетеді де, бактериялар осы фагтың əсерінен лизиске ұшырайды. Рестрикциялау жəне метилдеу ферменттері клетканың модификация-рестрикция жүйесін (MR) құрайды. Рестриктазалардың негізгі үш: I, II жəне III түрі белгілі. 141 Барлық рестриктазалар қос спиралды ДНҚ-ның белгілі нуклеотид- тер қатарын дəл тани алады. Алайда рестриктазалардың I түрі белгілі нуклеотидтер қатарын танығанымен, оны əрқилы нүктелерде үзеді, ал рестриктазалардың II жəне III типтері ДНҚ-ның нақты бөліктерін дəл үзе алады. Эндонуклеазалардың I жəне III тип құрылымы күрделі, екі модификациялық жəне АТФ-ға тəуелді эндонуклеазалық активтіліктері бар. Рестриктазалардың II типі екі жеке: рестрикциялаушы эндонукле- аза жəне модификациялаушы метилаза белоктан құралған. Аталған се- бептерге байланысты ген инженериясында тек қана рестриктазалардың II түрі пайдаланылады. Екінші жағынан, рестриктазаның II түрі ғана бірдей нуклеотид тізбектерінің бөлiктері бар ДНҚ дəрі-дəрмектерін алуға жəне əртүрлі геномдардан алынған бөлiктерден химерлі ДНҚ молекуласын құрастыруға мүмкіндік туғызады. Рестриктазалардың II түрінің басым көпшілігі 4-6 н.ж. құралған палиндромды ДНҚ тізбектерін тани алады. Мысалы, Вас. subtilis бактериясының ВsuR1 деп белгіленетін рестриктазасы ДНҚ бөлігін төмендегідей үзе алады: 5' – ГГ ↓ ЦЦ-3' 3' – ЦЦ ↑ ГГ-5' Əр тізбегі 3'-ұшынан 5' бағытына қарай көз жүгіртсе, олар бірдей оқылады (ЦЦ ГГ), міне, осындай тізбек паралиндром деп аталады. Нəтижесінде, ДНҚ-ның қос тізбегі симметриялы үзіледі (меңзермен көрсетілген), сақиналы ДНҚ түзу құрылымға айналады. ДНҚ молекуласының соңында жабысқақ ұштар пайда болады, сондықтан олар ешқандай қосымша өңдеусіз бір-бірімен қайтадан қосылуға қабілетті болады. Қазіргі кезде рестриктазалардың II түрінің 500-ден астам түрі белгілі жəне олар ДНҚ-ны бір-бірінен өзгеше 120 жерден үзе алады. 1973 ж. X. Смит жэне Д. Натапс рестрикция-модификация жүйе (МR) ферменттерін белгілеу номенклатурасын ұсынды. Көпшіліктің мақұлдауы бойынша туыстың бірінші əрпі жəне түрдің алғашқы екі əрпінен құралған үш əріп ферменттің шығу көзін көрсетеді. Эндо- нуклеазаларды – R, метилазаларды – М əріптерімен белгілейді. Егер клетканың бір түрінен екі жəне одан көп рестрикция ферменттері бөлінген болса, онда оларды рим цифрларымен (I, II, III т.с.с.) нөмірлейді. Осы номенклатура бойынша Е.cоli рестриктазасы ЕсоR1, ЕсоRII жəне т. б., ал Вас. subtilis рестриктазасы RsuRI т.с.с. белгіленеді. 142 4.1-кестеде ген инженериясында жиі қолданылатын рестриктазалар жəне олардың сипаттамасы берілген. 4.1-кесте Ген инженериясында пайдаланылатын кейбір рестриктазалар [http://ru.wikipedia.org/wiki] Рестриктазаны белгілеу Рестриктаза танитын тізбек Рестриктазаны белгілеу Рестриктаза танитын тізбек ЕсоR1 Г↓ААТТЦ ЦТТАА↑Г Xho I Ц↓ТЦГАГ ГАГЦТ↑Ц Hind III А↑АГЦТТ АТЦГА↑А Hind II ГРуц↓ГРиЦ ЦРиГ↑ЦРуГ Bam HI Г↓ГАТСС ЦЦТАГ↑Г Sau 3A ↓ГАТЦ ЦТАГ↑ Bg1 II А↓ГАТЦТ ТЦТАГ↑А Pvu II ЦАГ↓ЦТГ ГТЦ↑ГАЦ Ba1 I ТГГ↓ЦЦА АЦЦ↑ГГТ Kpn I ГГТАЦ↓Ц Г↑ЦАТГГ Pst I ЦТЦГА ↓Г Г↑АГЦТЦ Xba I Т↓ЦТАГА АГАТЦ ↑Т Sa1 I Г↓ТЦГАЦ ЦАГЦТ↑Г Sac I ГАГЦТ↓Ц Ц↑ТЦГАГ ЕсоRII ↓ЦЦАГГ ГГТЦЦ↑ Cfr6 I ЦАГ↓ЦТГ EcoR Y ГГТЦЦ↑ ЦТА↑ТАЦ Cfr9 I Ц↓ЦЦГГГ ГГГЦЦ↑Ц BsuR I ГГ↑ЦЦ ЦЦ↓ГГ Dpn I ГА↓ТЦ ЦТ↑АГ ДНҚ тізбегінің үзілуі симметрияның өсі бойынша жүрсе, онда «доғал» ұшты фрагменттер түзіледі (мысалы, Ba1 I немесе BsuR ре- стриктазалары) немесе симметрия өсінен біршама қашықтықта өтсе, онда шығыңқы «жабысқақ» 5' (ЕсоRI, Hind III жəне т.б. рестриктаза- лар) немесе 3' (Pst I рестриктазасы) ұштары бар фрагменттер түзіледі. Меңзермен рестриктаза үзетін сайттар (нүктелер) көрсетілген. Əртүрлі рестриктазалардың II түрінің ішінен ДНҚ-ның бір нуклео- тидтер қатарын танитын екі немесе бірнеше фермент кездеседі. Осын- дай жұп немесе топ эндонуклеазалар изошизомерлер деп аталады. Изошизомерлердің екі түрін ажыратады: нағыз изошизомерияда фер- 143 менттер белгілі бір нуклеотидтер қатарын танып, ДНҚ-ны бір нүктеде үзеді жəне жалған изошизомерияда ферменттер бір нуклеотидтер қатарын тани алғанымен, оларды əртүрлі үзеді. 4.1-сурет. ДНҚ-мен байланысқан EcoRI рестрикциялық фермент. Қос тізбекті ДНҚ молекуласы көрінеді (http://ru.wikipedia.org/wiki) 4.2-суретте ЕсоR1 рестрикциялық ферментінің танитын сайты жəне бұл сайтта қос спиральді ыдырататын учаскесі көрсетілген. 4-2-сурет. ЕсоR1 рестрикциялық ферментінің көмегімен белгілі бір нуклеотидтік тізбекті (рестрикция сайттарын) танитын сайт жəне бұл сайтта ыдырататын учаске бар (У. Клаг, М. Каммингс, 2007) Рекомбинантты ДНҚ техникасы үшін алуан түрлі рестрикция ферменттерінің ішінен өздеріне комплементарлы «жабысқақ» ұштары бар бөлiктер түзейтін рестриктазалар бағалы болып саналады. |