Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер
Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыру
жүктеу/скачать 5,04 Mb. Pdf көрінісі
|
Kenzhebayeva (1) (1) (1)
| 4.2. Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыру
Генетикалық инженерияның негізгі мағынасы болып рекомбинант- ты ДНҚ жүйесын құрастыру міндеті саналады. Рекомбинантты ДНҚ деп in vitro жағдайында шыгу көзі бойынша əртүрлі кез келген екі не- месе бірнеше ДНҚ фрагменттерін біріктіру арқылы түзілген ДНҚ-ны түсінеді. Рекомбинантты ДНҚ-ның қарапайым құрамы бөтен ДНҚ мен вектордан тұрады. Генетикалық инженерияның формальды тұрғыдан дүниеге келген уақыты 1972 ж. деп есептеледі, осы жылы П. Бэрг алғаш рет түтiкте үш түрлі микроорганизмдердің — маймылдың рак вирусының фагтың жəне бактериялық плазмиданың (вектордың) ДНҚ фрагменттерінен бірінші рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырды. Дегенмен бұл ДНҚ-ның клеткада жұмыс істей алатындығы тексерілмеді, өйткені құрамында рак вирусының гені болғандықтан, П.Бэрг тəуекелге бар- мады. Осы кезде П.Лобан да осындай рекомбинантты ДНҚ молекула- сын алу мүмкіндігін көрсетті. Бұл кезде рестриктазалар жəне оның қасиеттері ашылғап болатын. 1973 ж. С.Коэн жəне Г.Бойер плазмида негізінде векторларды құрастыру үшін рестриктазаларды пайдала- ну керектігін алғаш түсінді. Олар 1974 ж. клеткада кəдімгідей жұмыс істей алатын рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырды. 139 Рекомбинантты ДНҚ құрастырудың ең кең таралған əдісі рестрикта- заларды қолдануға сүйенеді. Ол жабысқақ ұштар əдісі деп аталады. Бұл əдісте рекомбинантты ДНҚ құрастыру Коэн-Бойер үлгісі бойынша іске асады. Генде (бөтен ДНҚ үзіндісі де) жəне векторда бір рестрикциялық ферменттің көмегімен үзіледі, нəтижесінде олардың ұштары бір-біріне комплементарлы, яғни жабысқақ болғандықтан, гибридтік (немесе химерлі) ДНҚ молекуласына ДНҚ лигаза ферментінің көмегімен оңай бірігеді. Жабысқақ ұштар əдісі өзі танитын ДНҚ бөлігін симметрия өсінен біршама қашықтықта үзетін рестриктазаларга сүйенеді. Рекомбинантты ДНҚ-ны жабысқақ ұштар əдісі бойынша құрас- тырудың жақсы жақтары жəне кемшіліктері бар. Алынған гибридтік ДНҚ тізбегінде рестриктаза тани алатын бөліктердің қалпына келуі əдістің жақсы жағын сипаттайды. Бұл бөтен ДНҚ фрагментін осы рестриктазаның əсерімен салыстырмалы оңай бөліп алуға мүмкіндік береді. Ал рестриктаза арқылы алынған барлық тізбектердің – жабысқақ ұштардың бір-бірімен (гомологты тізбектер) реассоцияла- нып (қайтадап бірігуі) кетуі əдістің кемшілігін көрсетеді. Осының нəтижесінде векторлық молекулалардың бірқатар бөлігі ендірмелермен емес, өз ұштарымен тікелей əрекеттесуі арқасында қалпына келеді, ал басқа векторлар болса, бірнеше біріккен бөтен ДНҚ молекулаларынан құралған ендірмелермен қосылып кетуі мүмкін. Сондықтан бір ғана ендірмесі бар гибридтік векторларды іректеу жұмысын іске асыру ке- рек. Бұдан басқа, бұл əдістің күрделілігі бар: рестриктаза танитын нүктелер тəжірибе үшін ыңғайлы бөлікте орналаспауы мүмкін, мы- салы, олар қажет геннің ішінде орналасады. ДНҚ-ның кез келген ұшын плазмидамен рекомбинациялау үшін пайдалануға мүмкіндік туғызатын басқа əдістер де бар. Гомополимерлі ұштар əдісінде немесе конекторлық симметрия өсімен үзетін рестриказа арқылы алынған ДНҚ фрагменттерінің «доғал» ұштарына (шығыңқы бір тізбекті бөлігі жоқ) терминалдық трансфераза ферментінің көмегімен гомонуклеотидтер, мысалы, ДНҚ-ның 3'-ұштарын поли (Т) немесе поли (Ц), ал векторлық ДНҚ- ның 3'-ұштарына поли (А) немесе поли (Г) жалғанады. Гомополимерлі ұштардан құралған ДНҚ фрагменттерін (бөтен ДНҚ жəне вектор) бір ортаға қосса, олар комплементарлы жұп негіздерін түзеп, оңай бір молекулаға бірігеді. Немесе ДНҚ бөлiкке де, вектордың ұшына да синтетикалық қос тізбек (линкер) жалғайды. Содан соң линкерді тани- 140 тын жəне оны жабысқақ ететін рестриктазамен үзеді. Бұл жолмен де жабысқақ ұштар алынады. Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырудың ыңғайлы əдісі – доғал ұштарды жалғау (тігу). Оның негізіне Т4 фагынан бөлінген ДНҚ-лигаза ферментінің доғал ұшты екі ДНҚ молекуласын жалғау қабілеттілігі жатады. Бұл əдістің артықшылығы оның кез келген соңғы нуклеотидтер тізбегін жалғай алатындығынан тұрады. Егер белгілі екі тізбекті араларын ендірмеусіз жалғау керек болса, онда бұл əдісті пай- далану өте ыңғайлы. Рекомбинантты ДНҚ құрастырудың қаралған үш əдісінің бірнеше модификациялары (өзгешеліктері) бар жəне де ген мен векторлық молекуланың ерекшелігіне байланысты əдістемесі əртүрлі болуы мүмкін. Көпшілік жағдайда линкер технологиясы қолданылады. жүктеу/скачать 5,04 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|