Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер

152
Сонымен, фагтың басына 25.0 мың н.ж. құралған бөтен ДНҚ-ны 
енгізуге болады (4.5-сурет). Фагтың қалыпты геномы 48,5 мың н.ж. 
құралғанымен, оның басына 38,0 мың н.ж. кем емес жəне 53,0 мың 
н.ж. артық емес ДНҚ жиналады, фагтың белокты капсиді ДНҚ-ның 
осындай мөлшерлерін қоршай алады. Лизистік дамуға қажет ген 29,0 
мың н.ж. тең болғанымен, вектордың қалыпты тіршілік етуіне қажет 
фаг геномының мөлшері 38,0 мың н.ж. кем болмауы керек. Қазіргі кез-
де лямбда фагтың негізінде аталған шектеулер мен фаг қасиеттерін 
ескеріп, түрлі рестриктазалардың көмегімен бірқатар векторлық моле-
кулалар құрастырылды: харон – λ фаг, λgt – фаг, ЕМВ13, λFIХ, λZАР 
жəне т.б.
Жалғыз тізбекті ДНҚ-сы бар М13 фаг негізінде де жақсы вектор-
лар алынды. Жетілген М13 фагының жалғыз ДНҚ молекуласының 
ұзындығы 6,5 мың н.ж. тең. Клеткаға енгеннен кейін қос тізбекті 
репликациялық формаға айналып, өзінің 100-200 көшірмесін синтез-
дейді. Ары қарай асимметриялы синтез жүреді: жетілген фагтың 
құрамына кіретін жалғыз тізбекті ДНҚ ғана синтезделеді. Клетка 
М13 фагында лизиске тар болмайды, бірақ оның бөлінуін бəсеңдетеді. 
Осының нəтижесінде жетілген фагтар клеткадан ортаға үздіксіз 
бөлініп тұрады. М13 фагының вектор ретінде негізгі артықшылығы –
жалғыз тізбекті векторлық ДНҚ-ны ыңғайлы жеке күйде тасымал-
дай алу қабілеті. Мұндай ДНҚ-ның нуклеотидтер қатарының Сэнгер 
əдісімен тез анықталуы генетикалық эксперименттерді жеңілдетеді. 
Тағы да, қазір пайдаланылатын барлық векторларға қарағанда, оларды 
бөлу жəне көшірмелерін алу оңайға соғады.
Жоғарыда баяндалғандай, фаг негізінде алынған векторлардың 
бірнеше артықшылығын байқауға болады. Бірақ олардың сыйым-
дылығы шектелген, сондықтан рекомбинантты ДНҚ-ны молекулалық 
салмағы бойынша іріктеу керек. Мұндай кемшілік космид деп аталып, 
векторлық молекулаларда кездеспейді.
Космидтер. Космид – лямбда фагтың соs учаскесі (жабысқақ 
ұштар) бар плазмидасы, яғни тіршілігі екіжақты ДНҚ-ның гибридтік 
молекуласы. Оларды алғаш рет 1978 ж. Дж.Коллинз бен Б.Хон ашты. 
Космидтің плазмидалық бөлігі оның бактерияларда репликациялану-
ына мүмкіндік береді, ал лямбда фагтың геномына жататын бөлігі – 
соs тізбек космидтің фаг капсидінің ішіне in vitro жағдайында оралуы-

153
на жəне реципиенттік клеткаға трансдукциялануына мүмкіндік береді. 
Сонымен, космидтер клеткаға трансформация жолымен емес, кəдімгі 
инфекция арқылы ене алады. Мұның өзі трансформация үдерісінің 
тиімділігін ең аз дегенде 100 есе арттырады.
Космидтік векторларда мөлшері 33-40 мың н.ж. бөтен ДНҚ 
фрагменттерін көбейтуге (клондауға) болады. Космидтер – сыйым-
дылығы ең үлкен векторлар, сондықтан эукариоттық ДНҚ-ның үлкен 
фрагменттерінің көшірмелерін жəне геномның гендер банкін (жинағын) 
клондардың барынша аз санымен алу үшін арнайы құрастырылған.
Фазмида. Фаг ретінде де, плазмида ретінде де дамуға қабілетті 
фаг пен плазмиданың арасындағы гибридтер фазмида деп аталады. 
Мұндай векторда СоlЕ1 мен лямбда фагтың инициация нүктесі бар 
жəне олар бактериофаг сияқты, лизистік плазмидалар сияқты, лизистік 
емес дамуға қабілетті.
Фазмидалық векторлардың сыйымдылығын лямбда фаг негізінде 
векторлармен салыстыруға болады, ол космидтерден анағұрлым аз.
Сонымен, жоғарыда баяндалған мəліметтерден ген инженериясының 
векторлар жүйесі микроорганизмдердің жəне олардың генетикалық 
элементтерінің қасиеттеріне негізделгенін байқауға болады. Вектор-
лық молекулаларға қойылатын негізгі талаптардың бірі – оларда 
рестрикциялық нүктелер болуы керек екендігін де атап өттік. Кейбір 
векторларда рестрикциялық бөліктер артық болуы мүмкін. Мұндай 
жағдайда ол бөліктерді векторлардан делеция (бір немесе бірнеше 
нуклеотидтерді ДНҚ-дан иондық сəулелер жəне т.б. əсерімен үзу) 
көмегімен үзеді.
Керісінше, вектордың қажет бөлігінде тəжірибе үшін аса керек 
жəне рестриктаза үзе алатын тізбектер жоқ болуы да мүмкін. Бұл үшін 
химиялық синтездеу арқылы рестриктаза тани алатын нуклеотидтер 
тізбегі бар қысқа синтетикалық олигонуклеотид алынады. Лигазаның 
көмегімен қысқа синтетикалық олигонуклеотид вектордың керек 
бөлігіне жалғанады. Оларды линкер – жалғаулық (ағылш. тілінде – 
біріктіру) деп атайды. Линкерде əртүрлі бірнеше рестриктаза үшін 
тізбектер бар болса, оларды полилинкер деп атайды.
Эукариоттық клеткаларда (ашытқыда) ДНҚ-ның фрагментін 
клондау (көбейту). Sассharomyces cerevisiae ашытқы қожайын клетка-
лар ретінде клондалған эукариоттық гендерді репликациялау жəне экс-
прессиялау бес себеп үшін кең қолданылады: 

154
1. Ашытқы эукариот организмдер болғандықтан, оларды бакте-
риалдық клеткалар сияқты зертхана жағдайында өсіру ыңғайлы.
2. Белсенді зерттеудің нəтижесінде ашытқының генетикалық кар-
тасы жəне мутацияларға байланысты деректердің қоры құрастырылған.
3. Барлық ашытқы геномдарының нуклеотидтік тізбегі толық 
анықталған жəне организмнің көпшілік гендері белгіленген. 
4. Біраз эукариоттық белоктардың қызметтерін зерттеу үшін мың-
дай қожайын клеткалар пайдалану қажет, өйткені оларда клондалған 
гендердің белок өнімдерінің посттрансляциялы модификациясы бола-
ды. Бактериалдық клеткаларда осындай өзгерістер болмайды. 
5. Ашытқы көп жылдар бойы нан өндірісінде жəне сыра қайнатуда 
пайдаланылады, сондықтан терапевтикалық вакциналарды жəне 
белоктарды өндіру үшін оларды қолдану қауіпсіз болып саналады. 
Синтезделген ашытқы қожайын клеткаларда рекомбинантты белок-
тар мыналар: гепатит В вирусының үстірт белогы, малярия паразитінің 
белогы, инсулин, эпидермалдық өсу факторы, тромбоцитарлық өсу 
факторы, альфа1-антитрипсин, XIIIА қанның ұю факторы. 
Ашытқы ДНҚ-ның негізінде бірнеше векторлық молекула түрлері 
құрастырылған. Оларды ДНҚ-ның бөлiктерінің алуан ұзындығын 
көбейту үшін пайдаланады. Осы вектордың бірі – ашытқы жасан-
ды хромосомы (ағылш. тіл. уеаst artifi cial chromosome – YАС) (4.9-су-
рет). Табиғи хромосом сияқты жасанды жасалған хромосомның əрбір 
соңында теломера, репликация бастауының учаскесі (ДНҚ синтездің 
бастапқы нуклеотид тізбегі) жəне цетромера бар. Репликация бас-
таушы учаскесі (ori) деп аталады. Осы құрамдас бөлiктер маркер-
лер гендерімен (ТRР1 жəне URA3) жəне рестрикциялық сайттардың 
кластерімен байланысады. Жасанды хромосомның мөлшері 230 мың 
жұп негізден 1900 жұп негізге түрлендіріледі. Осы себептен ашытқы 
жасанды хромосомда мөлшерлері 100 мың жұп негізден 1000 жұп 
негізге дейін ДНҚ-ның бөлiктерін көбейтуі мүмкін. Сондықтан век-
торларда əртүрлі организмдердің геномдарын, оның ішінде адамның 
геномын зерттеуге мүмкіндік береді. 
Қазіргі уақытта ашытқы векторлар ДНҚ-ны көбейту үшін көп 
қолданылады. Сонымен қатар жануарлардың жасанды құрастырылған 
хромосомын пайдалану үшін векторлар ретінде ДНҚ-ны көбейту 
əдістері, ал қожайын клеткалар ретінде жануарлардың ұлпа клетка-
ларының түрлері өңделеді.

155
4.9-сурет. Жасанды хромосомда ДНҚ-ның бөлiктерін клондау. 
Құрастырылған хромосомда ашытқының төртінші хромосомнан алынған 
теломерлік (ТЕL) жəне центромерлік (СЕN4) тізбектері бар. 
Сонымен қатар хромосомда репликация бастаушы учаскесі (ori) бар. 
Осы элементтер векторға хромосомның қасиеттерін береді. ТRР1, SUР4, 
URA3 – ашытқының гендері. Олар хромосомның сол жəне оң иығына 
сəйкес маркерлік гендері болып табылады. SUР4 геннің ішінде SпаВ1 
рестриктазаның танитын сайттары бар. ВamНI рестриктазаның екі 
рестрикция сайты бөтен ДНҚ-ның енген аймағын екi қанаттан 
атқылайды. SпаВ1 жəне ВamНI рестриктазаларына арналған 
хромосомның ыдырау нəтижесінде ДНҚ-ның екі бөлігі – хромосомның сол 
жəне оң иықтары пайда болады. Клондауға қажет ДНҚ ВamНI 
рестриктазасына арналған бөлiктер қалыптасады. Хромосомның 
иықтар жəне қажет ДНҚ бөлiктері байланысады, жасанды 
хромосом ашытқы клеткаларға енгізіледі. Ашытқы үлкен хромосомдар 
болғандықтан, осы жасанды хромосомға мөлшері миллион жұп негізден 
тұратын ДНҚ-ның бөлiктерін енгізуге болады 
(У. Клаг, М. Каммингс, 2007)

156

жүктеу/скачать 5,04 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: