Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер
Бөтен генді алу жəне оны плазмидаға тігу əдістемесі
жүктеу/скачать 5,04 Mb. Pdf көрінісі
|
| 4.6. Бөтен генді алу жəне оны плазмидаға тігу əдістемесі
Жаңа құрылымдық гендерді иеленген клеткалардағы гендер өз бетімен тиісті қызмет атқара алмайды. Гендердің клеткадағы əрекетін басқаратын репликация жəне транскрипция дабылдарын вектор қамтамасыз етеді. Гендік инженерия көмегімен зертхана жағдайында генетикалық құрастырылған рекомбинантты ДНҚ молекуласы бөтен организмге енгізіледі. Осы кезде рекомбинантты ДНҚ реципиент организмнің бөлшегіне ерекше жаңа биохимиялық, физиологиялық, генетикалық қасиеттерге ие болады. Осыған байланысты рекомби- нантты ДНҚ-ны алу гендік инженерияның негізгі мақсаты болып та- былады. Рекомбинантты ДНҚ-ны пайдалану арқылы РНҚ молекуласын синтездеп, одан кейін белок молекуласын қажетті өлшемде, мөлшерде синтездеп, бөтен организмдегі жаңа ген экспрессиясын жүзеге асыруға болады. Рекомбинантты дегеніміз – in-vitro жағдайында екі немесе одан да көп ДНҚ фрагменттерін біріктіру. Бөтен генді клетка ішіне тасымалдап, арнаулы ДНҚ молекуласын вектор деп атаймыз. Оған төмендегідей талаптар қойылады. 1. Өз алдына репликациялану, яғни клетка ішіне бөтен генді алып кірген соң, клеткамен бірге немесе өз алдына көбейе алатын болуы керек; немесе вектор клетка хромосомының құрамына еніп, онымен бірге ұрпақ клеткаларына беріліп отыруға тиіс. 2. Трансформацияланған клеткаларды анықтау үшін оның ерекше генетикалық белгілері болуы керек. 3. Құрамында рестриктазалар үзе алатын нуклеотидтер тізбегі бо- луы жəне репликацияға қабілетін жоғалтпауы керек. 4. Векторларға орналастырылған бөтен ген оның атқаратын қызметін бұзбауы, ал вектор болса енгізілген геннің ішінде дұрыс реттеліп, жұмыс істеуін қамтамасыз ететін болуы керек. Вектордың көлемі кішігірім болуға тиіс. Бұл жұмыстың негізі плазмида мен ДНҚ фрагменттерін біріктіру болып табылады. ДНҚ гені дегеніміз – канамицин антибиотигіне төзімді ДНҚ фрагментін бір гибридті молекулаға біріктіру. Бұл мəселені шешу үшін плазмидті ДНҚ-мен қатар рестриктаза жəне ли- газа ферменттері қажет. Рестриктазалар тізбекті доғал жəне жабысқақ ұшты бөлiктерді кесе алады. Мысалы, EcoR1 жəне HindIII сияқты ре- стриктазалар бір тізбекті ДНҚ тізбектеріне еніп, симметриялы түрде кеседі де, нəтижесінде бір тізбекті комплементарлы ұштары бар ДНҚ 157 фрагменттері пайда болады. Оларды жабысқақ ұшты бөлiктер деп атайды, себебі ол ұштардың бір-бірімен байланысу мүмкіндігі бар. Ол жабысқақ ұшты бөлiктер лигаза ферменті арқылы тігіледі. Рестриктазалар (Taq1, Sau3A, Sma1) ДНҚ рестрикциялық сайтта- рын симметриялы түрде кеседі. Сол кезде шығыңқы ұштар етіп емес, мұқалбасты ұштар жасап кеседі. ДНҚ-ның қалай жəне қандай рестрик- тазалармен кесілгендігіне байланысты, тігу үдерісінің рестриктазаға еш қатысы болмайды. Тігу (ағылш. тіл. ligation) дегеніміз – екi сызықты нуклеин қышқылдары молекулаларының фосфодиэфирлік байланыстары арқылы байланысу үдерісi. Бұл үдеріс ДНҚ-лигаза фер- мент қатысуымен iске асады. Тігу гендiк инженерияда – тəсіл, оның көмегiмен плазмидаға бөтен ДНҚ икемделеді. Жабысқақ ұштарды байланыстырып жабыстырғанда, ДНҚ-ның бүтіндігі қалпына келмейді, себебі фосфодиэфирлік байланыстар ара- сында екі үзілген тұсы қалады, ал ковалентті байланысты қалпына келтіру үшін лигаза ферментін пайдаланады. ДНҚ бөлiктерін байла- ныстыру үшін Т 4 бактерифагының ДНҚ лигазасы қолданылады. Тірі клеткада да бұл фермент дəл осы қызметтін атқарады. Репликация кезіндегі синтезделуші ДНҚ бөлiктерін тігіп, рекомбинантты ДНҚ пайда болу үдерісін аяқтайды. Тігу үдерісінің тиімділігі əртүрлі факторларға, температураға, реакцияның жүру барысына, рестрикцияланған ДНҚ бөлiктерінің кон- центрациясына байланысты болады. Молекулалық биология жəне гендік инженерияда қолданылатын əдістердің бірі – плазмидалық вектордың құрамындағы ДНҚ фраг- ментін клондау. Клондау кезіндегі клондайтын фрагменттерден гибридті молекуланы жасауға рестриктазаны таңдау төмендегі ереже- лерге сай жүреді. Таңдалған рестриктаза бізге қажетті фрагментті кесе алуы керек. Рестриктазалық фермент плазмидалық ДНҚ тізбегін тек қана бір жерден кесуі, мысалы, сақиналы ДНҚ-ны бір тізбекті етіп кесуі ке- рек, егер үзінділер көп болып кетсе, сақиналы плазмидалар бірнеше бөлiкке бөлінеді де, оны жинақтау керек болады. Енді npt2 генін клондау кезіндегі рекомбинантты ДНҚ-ның пайда болуы үдерісін қарастырайық. Ол генді канамицинге төзімді PUC19 де- ген векторлық плазмидаға клондаймыз. Рестрикциялық картаға сəйкес рестриктаза EcoR1 ферменті npt2 гені бар ДНҚ фрагменттерін кеседі де, жабысқақ ұштар пайда болады. Сонымен қатар бұл рестриктазаның 158 PUC19 генінің арнайы сайттарын кесетін рестрикциялық сайттары бар, осы сайттар арқылы сақиналы молекула бір тізбектіге айналады. Осы кезде жабысқақ ұштарды ДНҚ фрагменті мен плазмидалық ұштары бір-біріне комплементарлы ұштарды лигаза ферменті арқылы жалғап байланыстырады. Реакция аяқталған соң, рестриктаза ферментінің əсерін температураны жоғарылату арқылы бəсеңдетеді. ДНҚ лига- заны қосқанда, жабысқақ ұштар бір-бірімен байланысып, рекомби- нантты молекула пайда болады. Рестрикциялық ДНҚ плазмидасы мен фрагментті лигирлеу үшін эквимолярлы қатынастағы лигирлеу буферін қосады. ДНҚ лигаза мен Т 4 бактерифаг 1-2 сағат бөлме тем- пературасында инкубацияланады. Гибридті плазмидаларды агарозды электрофорезде немесе E.coli бактериялық клеткаларға трансформа- циялап, канамицинге төзімді ортаға егеді де, сол кезде гибридті плаз- мидаларды анықтап, іріктеп алуға мүмкіндік туады. Жұмыс жасау барысы: Түтiкке ДНҚ рестрикциялық тізбекті жəне PUC19 векторлық плазмидалық векторды, EcoR1 рестриктазасы бар ерітіндіні дайындаймыз. Оның құрамына 4,5 мкл бидистильденген суды, 1 мкл 10 еселік рестрикцияға арналған буферді, 3,5 мкл ДНҚ тізбегін жəне PUC19 (1 мгк/мкл ), 1 мкл EcoR1 рестриктаза 10 ед/ мкл тамызғышпен ақырын ғана араластырып, 37°С 1 сағат бөлме темпе- ратурасында инкубациялайды. Ерітіндіні түтiкшемен 65°С 1 сағат су моншасында 15 минут рестриктаза инактивациясы үшін ұстайды. Одан кейін ерітіндіге 7 мкл EcoR1 ферментін, npt2 генінің 7 мкл ДНҚ-сын қосады. 2 мкл лигазалық буфер жəне 1 мкл 10 ед/ мкл лигаза қосады да, мұқият араластырып, бөлме температурасында 1 сағат инкубация- лайды. жүктеу/скачать 5,04 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|