Қожайын клеткаларсыз ДНҚ-ны клондау – полимеразалық

159
тікелей секвинирлеу үшін, патогенді микроорганизмдерді табу үшін, 
мРНҚ-ның 3' жəне 5' соңдарын амплификациялау (көбейту) үшін, 
гендерді синтездеу үшін гендегі делеция мен кірігулерді табу үшін 
қолданады. ДНҚ аплификациясымен (көшірме санын көбейту) қатар, 
ПТР нуклеин қышқылдарымен басқа да көптеген əрекет өндіруде (му-
тация енгізу, ДНҚ ферментін өсіру) жəне биология мен медицинада 
кеңінен қолданылады, мысалы, ауруларды диагностикалауға (тұқым 
қуалаушы, инфекциялы), əкелікті дəлелдеуге, генді клондауға, жаңа 
гендерді бөліп алуға мүмкіндік береді.
Комплементарлы тізбектерді бір-бірімен байланыстыратын сутектік 
байланыстарды үзу үшін бастапқы ДНҚ молекуласын қыздырады. 
Реакциялы қоспаны екі қысқа (12-20 н.ж.) ДНҚ молекуласымен қоса 
суытады. Ол фрагменттің біреуі – зерттелетін локустан ДНҚ сол 
жағындағы тізбекке, екіншісі – екінші ДНҚ тізбегінің оң жағындағы 
комплементарлы тізбектер. Бұл праймер деп аталатын фрагмент-
тер ДНҚ-ның сəйкес бөліктерімен байланысып, ДНҚ матрицасында 
жаңа комплементарлы тізбек синтезін бастайды. Бұл синтезді ДНҚ-
полимераза жүргізеді. Келесі сатыда реакциялық қоспаны тағы да 
қыздырып, қайтадан синтезделген ДНҚ тізбектерін матрица ретінде 
пайдаланады. 
ПТР əдісіне ДНҚ-ның репликациясы, яғни ДНҚ-полимераза 
ферментінің қатысуымен ДНҚ матрицасына комплементарлы жаңа 
тізбектің түзілуі негіз болады. 
Бастапқы сипаттағы ДНҚ фрагментінің жеткілікті көшірмелерін 
алу үшін ДНҚ амплификациясы бірнеше кезеңде (20-40) жүргізіледі. 
Əр амплификация 3 сатыны қамтиды, олар өз алдына түрлі 
температуралық режимде өтеді.
1-саты: 93-95°С 30-40 секунд аралығында ДНҚ-ның денатурация-
сы өтеді – қос тізбекті спиральдің ширатылуы жүзеге асады.
2-саты: праймерлердің қосылуы. Праймерлердің қосылуы маман-
данған аймақ шекараларында ДНҚ тізбегіне комплементарлы прин-
циппен жүзеге асады. Əрбір праймердің жұбы үшін температуралық 
мəні 50-65°С аралығында болады. Праймерлердің қосылу уақыты –
20-30 сек.
3-саты: ДНҚ тізбегінің құрылуы. ДНҚ тізбегінің комплементарлы 
құрылуы праймерлер қосылған аймақтардан басталып, 5'-3' бағытында 
жүреді. Ерітіндіге қосылған дезоксирибонуклеотид үш фосфат (дНТФ) 

160
ДНҚ тізбегінің түзілуіне қажетті материалдар болып табылады. Син-
тез үдерісін 70-72°С аралығында термотұрақты ДНҚ полимераза (Тaq 
полимераза) катализдейді. Синтездің жүру уақыты – 20-40 сек. Бірінші 
сатыда түзілген көбейтiлген жаңа ДНҚ тізбектері екінші сатыдағы 
көбейту матрица ретінде қолданылады. Соңғылары тиісінше келесі 
сатыдағы жаңа ДНҚ тізбектерінің түзілуіне қатысады. Осы реттілікпен, 
2n формуласындағыдай, ампликондар жинақталады, мұндағы n – ам-
плификация сатысының саны. Осығай орай, егер бастапқыда ерітіндіде 
1 ДНҚ қос тізбегі болса, ал 30-30-40 кезең ішінде 108-ге жуық ампли-
кон молекулалары жинақталады. Бұл көлем бөлiгі агарлы гель электро-
форез əдісі арқылы көз мөлшерiмен детекциялауға жеткілікті болады. 
Көбейту үдерісі арнайы бағдарламалы термостатта (амплификаторда) 
жасалады. Онда берілген бағдарлама бойынша көбейту сатыларының 
санына қарай автоматты түрде температураны өзгертіп отырады. 
Полимеразалық тізбектік реакцияны қолданып, белгілі бір микро-
организмге тəн инфекциялық ауруды қоздыратын кішігірім ДНҚ 
фрагментін табу жəне оны көбейту – ПТР əдісінің негізі болып табы-
лады.

жүктеу/скачать 5,04 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: