Курс лекций для студентов специальности -48 02 01 «Биотехнология» Минск 2014 034)

82 
lus subtilis; пектофоетидин 
 пектиназа, Aspergillus foetidus; амилори-
зин 
 амилаза, Aspergillus oryzae. В наименовании препарата указы-
ваются также способ культивирования микроорганизма (П 
 поверх-
ностный, Г 
 глубинный) и индекс, характеризующий степень очист-
ки препарата, в виде цифры перед буквой «х» (х, 2х, 3х, 10х и т. д.). 
Чем больше цифра, тем выше степень очистки:
 Пх, Гх  исходная культура продуцента без какой-либо очистки; 
 П2х, Г2х  жидкий концентрат растворимых веществ исходной 
культуры (40
50% сухого вещества), освобожденный от нераствори-
мых веществ;
 П3х, Г3х  сухие ферментные препараты, полученные сушкой 
экстракта поверхностной культуры или жидких концентратов П2х, Г2х; 
 П10х, Г10х  сухие препараты, полученные осаждением фер-
ментов из водных растворов органическим растворителем или вы-
саливанием; 
 П20х, Г20х  высокоочищенные, но не кристаллические фер-
ментные препараты, содержащие до 25% балластных веществ. 
Препараты ферментов с индексом 10х и выше относят к очищен-
ным, с меньшей величиной индекса 
 к техническим.
В производственных условиях продуценты ферментов культиви-
руют как глубинным, так и поверхностным методом. Независимо от 
способа характерным свойством многих ферментов является их ин-
дуцибельность. Индуктором биосинтеза ферментов чаще всего вы-
ступает субстрат, на который данный фермент действует, а также 
продукты частичного гидролиза или некоторые аналоги субстрата. 
Например, индуктор биосинтеза амилаз – крахмал, пектиназ 
 пекти-
новые вещества. 
Для поверхностного культивирования продуцентов ферментов 
(мицелиальных грибов) используется кюветный способ. Открытые 
кюветы (600×800×30 мм) с перфорированным днищем располагаются 
ярусами высотой до двух метров на стационарных стеллажах или по-
движных этажерках, которые размещаются в растильной камере объ-
емом 90 м
3
(3×3×10 м). Растильная камера оборудована кондиционе-
ром для стабилизации параметров (температуры и влажности) подава-
емого в камеру воздуха. Расход воздуха рассчитывают не только на 
обеспечение растущих грибов кислородом, но и на отвод выделяемого 
ими биологического тепла. 
Основной компонент среды при поверхностном культивирова-
нии – пшеничные отруби, содержащие все необходимые питательные 

83 
вещества для роста и развития грибов. Для повышения активности 
ферментов в питательную среду вводят различные добавки: свекло-
вичный жом (индуктор синтеза пектолитических ферментов), соевую 
муку (индуктор протеаз), пивную дробину или солодовые ростки (ин-
дуктор амилаз), овсяную шелуху, древесные опилки (разрыхлители 
среды). Питательную среду стерилизуют в шнековом стерилизаторе, 
обогреваемом глухим паром. 
Оптимальная для продуцирования ферментов влажность сре-
ды 
 55–70%. Чрезмерное увлажнение нарушает рыхлую структуру 
среды, уменьшает доступ кислорода к культуре и замедляет биосин-
тез. Низкая влажность способствует ускоренному переходу культу-
ры к спорообразованию, что используют при производстве посевно-
го материала. 
Посевной материал представляет собой поверхностную культуру, 
выращенную на твердой среде, споровый материал или мицелиальную 
массу продуцента, накопленную глубинным культивированием. По-
севную поверхностную культуру получают выращиванием гриба во 
всевозрастающем количестве в 3 или 4 этапа: в пробирке с 1,0–1,5 г 
стерильных отрубей, в колбах со 100 г той же среды, в колбах (бан-
ках) с 300–500 г среды и в посевных кюветах. На всех этапах выращи-
вание осуществляют при температуре (28 
 2)°С до обильного споро-
образования. Чтобы продлить срок хранения, посевную культуру под-
сушивают до влажности 10–12% продувкой воздухом в растильной 
камере и хранят в полиэтиленовых пакетах при 4–6°С. 
Для получения спорового материала в специальном вибросепара-
торе потоком воздуха отделяют конидии от основной массы поверх-
ностной культуры. Мицелиальную массу накапливают культивирова-
нием гриба на жидкой среде в инокуляторе. 
Выращивание поверхностной культуры длится 36–48 ч. За этот 
период гриб проходит три стадии роста. Первая стадия (10–12 ч) 
 
набухание конидий и их прорастание. На этом этапе воздухообмен 
в камере составляет 4–5 объемов в час, температура воздуха – 28°С. 
Вторая стадия (14–18 ч) 
 активный рост мицелия, сопровождающий-
ся выделением большого количества тепла (около 4000 кДж/кг куль-
туры). В растильную камеру подают 40–60 объемов воздуха в час при 
температуре 26–28°С. Третья стадия (12–18 ч) характеризуется за-
медлением процессов обмена при еще активном образовании фермен-
тов и начале образования конидий. Воздухообмен уменьшают в 3
5 
раз по сравнению со второй стадией. По завершении третьего этапа 
в растильную камеру подают воздух с температурой 38–40°С и в те-

84 
чение 3–6 ч подсушивают культуру до влажности 35–45%, что облег-
чает отделение ее от перфорированной поверхности кювет и после-
дующую обработку. Растильные камеры работают по следующему 
режиму: загрузка 
 2 ч, культивирование гриба  22–30 ч, подсушка 
культуры 
 3–6 ч, разгрузка  2 ч, уборка и мойка камеры  1 ч, обра-
ботка формалином, аммиаком (для удаления формалина) и паром 
 
3 ч, аэрирование 
 3 ч. 
Поверхностный метод отличается большими затратами ручного 
труда, малой производительностью растильных камер, потребностью 
в больших производственных площадях. Преимущество метода 
 вы-
сокое содержание фермента в массе поверхностной культуры.
В современных условиях поверхностное культивирование грибов 
производят в механизированных установках, среди которых наи-
больший интерес представляет колонный аппарат с жалюзийными 
тарелками, на которых грибы выращивают в слое сыпучей среды 
толщиной до 300 мм. 
Глубинное культивирование продуцентов ферментов имеет ряд 
преимуществ перед поверхностным: позволяет значительно сокра-
тить производственные площади, исключает непроизводительный 
ручной труд, улучшает гигиену труда, позволяет автоматизировать 
производство. При глубинном культивировании улучшается степень 
использования компонентов питательной среды, сокращается объем 
отходов производства, облегчается получение очищенных препара-
тов ферментов. 
Ферментацию осуществляют в строго асептических условиях. 
Основные компоненты питательных сред при глубинном культивиро-
вании продуцентов ферментов 
 картофельный и кукурузный крах-
мал, кукурузная мука, кукурузный экстракт, макро- и микроэлементы. 
Одним из важнейших микроэлементов, стимулирующих образование 
протеиназ мицелиальными грибами, является цинк. При глубинном 
культивировании более отчетливо выражена индуцибельность синтеза 
ферментов. Большинство ферментов 
 экстрацеллюларные продукты, 
выделяющиеся в окружающую жидкую среду. В мицелии остается, 
как правило, не более 10–15% от всех ферментов. 
Оптимальное значение рН среды для биосинтеза ферментов зави-
сит от особенностей продуцента, но имеются и общие закономерно-
сти. Грибы и дрожжи хорошо растут и образуют ферменты при рН 
среды 3,8–5,6, бактерии лучше всего развиваются при рН, близком 
к нейтральному (6,2–7,4). В зависимости от состава среды и продук-
тов метаболизма рН среды при ферментации может понижаться или 

85 
повышаться. Уровень и скорость образования ферментов зависит от 
интенсивности аэрации ферментационной среды. В целом увеличение 
степени аэрирования среды приводит, как правило, к интенсификации 
биосинтеза ферментов и сокращению длительности культивирования. 
Поверхностная культура содержит большое количество балласт-
ных веществ, поэтому из глубинных культур легче получить очи-
щенные препараты ферментов. Но в этом случае выделять ферменты 
приходится из очень разбавленных растворов. Доля собственно 
ферментов составляет около 1% в поверхностных и не более 0,1% 
в глубинных культурах. На рис. 8.1 представлена принципиальная 
схема выделения и очистки ферментов из поверхностной и глубин-
ной культур. 
В некоторых отраслях возможно использование неочищенных 
препаратов ферментов. Поверхностная культура нестабильна при хра-
нении из-за повышенной влажности. Ее измельчают в дробилках до 
частиц размером 5−6 мм и высушивают в барабанных или конвейер-
ных сушилках до влажности 10–12% при температуре теплоносителя 
80–85°С. При этом материал не должен разогреваться до температуры 
более 40–42°С. Глубинная культура может быть использована в виде 
культуральной жидкости, освобожденной или не освобожденной от 
взвешенных веществ. Такие простейшие препараты имеют марку Пх 
и Гх соответственно. 
Очищенные ферментные препараты получают из экстракта по-
верхностной культуры и фильтрата культуральной жидкости. Фер-
менты являются водорастворимыми белками и экстрагируются водой. 
Для извлечения ферментов из дрожжей или бактерий необходимо 
предварительное разрушение клеточных стенок. Диффузионное со-
противление оболочек мицелия намного меньше, и дезинтеграция 
культур грибов не требуется. 
Экстракцию ферментов из сухой и измельченной поверхностной 
культуры проводят в диффузионной батарее из 8–10 аппаратов объе-
мом по 300 л или в экстракторах непрерывного действия. Применяе-
мая в качестве экстрагента вода содержит антисептик и имеет темпе-
ратуру 25–28°С. В большинстве случаев ферменты наиболее полно 
извлекаются при рН 5–7. Экстракцию проводят в режиме противотока 
с расходом воды 200–400% по отношению к массе культуры. Экстракт 
содержит 10–14% сухих веществ. 
Экстракт из поверхностной культуры грибов и фильтрат глубин-
ной культуры нестабильны при хранении. Для получения товарных 
форм ферментных препаратов их необходимо сконцентрировать. 

86 
Рис. 8.1. Принципиальная схема получения технических и очищенных 
ферментных препаратов из культур микроорганизмов 
Ферменты очень чувствительны к термической обработке 
и нуждаются в мягких режимах концентрирования. Известно, что 
примеси в растворе повышают термическую устойчивость фермента. 
Чем чище перерабатываемый раствор фермента, тем больше его по-
Выращенная 
поверхностным
способом 
Культура 
микроорганизма
Выращенная
глубинным 
способом 
Водная экстракция 
Концентрат, готовый 
к употреблению П2х 
Фильтрование
Концентрирование 
ультрафильтрацией 
или вакуум- 
выпариванием 
Нерастворимый 
осадок 
(биошрот) 
Экстракт, 
содержащий 
фермент 
Концентрат фильтрата
глубинной культуры 
Г2х
Фильтрат 
культуральной 
жидкости 
Технический сухой 
препарат П3х 
Влажный 
ферментный 
препарат 
Очищенный сухой 
ферментный 
препарат П10х 
Высокоочищенный 
ферментный 
препарат 
из поверхностной 
культуры 
П20х 
Сушка 
распылением 
Осаждение органическими 
растворителями или солями 
Сушка сублимацией 
или в вакуум- 
сушильном шкафу 
Растворение, диализ, 
аффинная хроматография,
гель-фильтрация, 
переосаждение, сорбция, 
кристаллизация, сушка 
Биомасса 
продуцента 
и твердая взвесь 
среды (биошрот)
Технический сухой 
препарат Г3х 
Влажный 
ферментный 
препарат 
Очищенный сухой 
ферментный 
препарат Г10х 
Высокоочищенный 
ферментный 
препарат 
из глубинной 
культуры 
Г20х 

87 
тери в результате термической инактивации. В производственных 
условиях концентрирование растворов чаще всего осуществляют 
упариванием при глубоком вакууме (температура кипения раствора 
до 30°С). Но избежать значительных потерь активности не удается. 
Наиболее перспективный метод концентрирования ферментных 
растворов 
 ультрафильтрация, которую проводят при комнатной 
температуре с малыми энергетическими затратами и при отсутствии 
тепловой инактивации фермента. Рабочим элементом ультрафиль-
трационной установки является полупроницаемая мембрана, которая 
обладает высокой селективностью и обеспечивает разделение низко- 
и высокомолекулярных соединений с получением концентрата высо-
комолекулярных соединений (ферментов). Таким образом, ультра-
фильтрация позволяет сконцентрировать ферментный раствор и од-
новременно очистить его. 
Кроме селективности мембраны должны обладать высокой про-
пускной способностью, механической прочностью, химической 
и биологической инертностью, стабильностью пористой структуры. 
Наиболее высокопроизводительны и компактны установки с элемен-
тами из полых волокон диаметром 50–250 мкм и толщиной стенки 15–
100 мкм. Фильтрующая поверхность таких установок достигает 
20 000 м
2
/м
3
(производитель фирма «DuPont», США). Метод ультра-
фильтрации перспективен как на стадии концентрирования фермент-
ных растворов, так и в качестве способа очистки ферментов.
В производстве очищенных ферментных препаратов широко 
применяется метод осаждения ферментов из растворов органическими 
растворителями или (реже) высококонцентрированными растворами 
солей (высаливание). Эффект осаждения белков связан с тем, что ор-
ганические растворители и ионы солей разрушают гидратную оболоч-
ку молекулы белка. При этом растворимость белков падает, происхо-
дит агрегирование и осаждение белковых молекул. Агрегирование 
белков осуществляется за счет электростатических и Ван-дер-
Ваальсовых взаимодействий между белковыми молекулами. 
В производстве для осаждения ферментов используют этанол, аце-
тон, изопропанол. Наиболее эффективен изопропанол. Белки осаждают-
ся при сравнительно низкой концентрации изопропанола (52–53%), 
а препараты содержат меньше балластных веществ. Последовательным 
увеличением концентрации растворителя в растворе можно осуще-
ствить фракционирование ферментного комплекса. Например, при кон-
центрации этанола 48–52% осаждается протеаза из раствора комплекса 
ферментов Aspergillus oryzae. После отделения осадка протеазы концен-
трацию этанола повышают до 70–74%, и в осадок выпадает амилаза. 

88 
При смешивании растворителя и водного раствора фермента вы-
деляется тепло и температура смеси повышается на 5–10°С. При 
температуре смеси 10–15°С наблюдается инактивация фермента. 
Причем имеет место не только термоинактивация. Увеличение тем-
пературы в присутствии растворителя приводит к нарушению струк-
туры фермента и часто к изменению конформации активного центра 
с потерей ферментом каталитической активности. В связи с этим 
длительность его контакта с растворителем должна быть сведена 
к минимуму. Оптимальная температура осаждения, равная 3–5°С, 
достигается охлаждением раствора фермента до 1–3°С, а растворите-
ля 
 до температуры от 8 до 10°С. Наиболее полно ферменты оса-
ждаются при величине рН, близкой к изоэлектрической точке. От-
клонение величины рН от данной точки снижает выход осадка и ак-
тивность фермента. 
Для высаливания ферментов часто используют сульфат аммония, 
реже – хлорид натрия, сульфат цинка и другие соли. Осаждение про-
водят раствором с концентрацией соли 0,5
0,9 от полного насыщения. 
Осажденные ферментные препараты содержат 20–80% соли от массы 
осадка, что не всегда удовлетворяет потребителя. В отличие от рас-
творителей, которые легко регенерируют ректификацией, регенерация 
соли представляет собой сложную задачу. Положительным фактором 
является то, что осадки, полученные при высаливании, содержат 
меньше балластных веществ и лучше растворяются в воде, что важно 
для их дальнейшей обработки. 
Белки могут агрегироваться без денатурации в присутствии высо-
комолекулярных нейтральных водорастворимых полимеров. Например, 
в промышленных условиях используют полиэтилен-гликоль (ПЭГ) 
с молекулярной массой 6000 и 20 000 Да, декстраны. Для осаждения 
ферментов требуются низкие концентрации ПЭГ в смеси 
 612%. 
В лабораторной практике при получении высокоочищенных фер-
ментов применяют ряд других методов, перспективных для промыш-
ленного использования: ионообменную хроматографию, аффинную 
адсорбционную хроматографию, хроматографию на окрашенных ад-
сорбентах (фермент проявляет сродство к красителю) и некоторые 
другие. Весьма эффективен для разделения и очистки ферментов 
в производственных условиях метод гель-фильтрации. 
Завершает стадии выделения и очистки сушка ферментных пре-
паратов. Жидкие полупродукты сушат в распылительных сушилках 
в мягких условиях: температура теплоносителя на входе не должна 
превышать 130°С, на выходе 
 50–70°С. Снижает потери фермента-

89 
тивной активности введение в жидкий полупродукт наполнителя 
(например, NaCl). Влажные осадки высушивают в вакуумных су-
шильных камерах или в барабанных вакуум-сушилках, обогреваемых 
водой с температурой 50–60°С. Продолжительность сушки – 10–14 ч. 
В качестве примера рассмотрим отечественную технологию про-
изводства глюкаваморина Г2х. 
Продуцентом амилаз является гриб Aspergillus awamori ВУДТ-2, 
который размножают на среде Чапека с сахарозой или крахмалом (2–
3%). Глюкоамилазная активность культуры – не менее 180 ед./см
3
. 
Конидиальный посевной материал получают на твердой питательной 
среде (пшеничные отруби и солодовые ростки в соотношении 1 : 1 по 
массе) в колбах объемом 750 см
3
(30–40 г среды). После засева куль-
турой из пробирок со средой Чапека колбы термостатируют 5–6 суток 
при температуре 30°С, а затем выдерживают при комнатной темпера-
туре 7–8 суток (до обильного конидиеобразования). Поученным ко-
нидиальным материалом в виде водной суспензии засевают посевной 
аппарат из расчета 10–15 г культуры на 1 м
3
питательной среды, 
имеющей следующий состав (в %): кукурузная мука – 5,0; кукуруз-
ный экстракт – 1,0. Величина рН исходной среды –
4,8–5,0. В смеси-
теле готовят водно-мучную суспензию, добавляют кукурузный экс-
тракт, подогревают до 57–80°С и подают в посевной аппарат, в кото-
ром питательную среду стерилизуют при 125–130°С в течение 1,5 ч. 
Охлажденную до 28–30°С питательную среду засевают культурой из 
колб. Продолжительность накопления биомассы гриба в посевном 
аппарате – 20–24 ч. 
Производственная среда содержит (в кг/м
3
): кукурузную муку – 
300; ячменный солод для разжижения мучного замеса – 1,5; гидро-
фосфат аммония – 4,5; ячменный солод для осахаривания крахмала – 
7,5. Величина рН среды – 3,5–4,8. Технологическая схема приготовле-
ния питательной среды представлена на рис. 8.2. 
Кукурузная мука смешивается в шнековом смесителе с водой 
(температура 40°С) в соотношении 1 : 3. Водно-мучная суспензия 
в емкостном смесителе обогащается гидрофосфатом аммония и раз-
жижается ячменным солодом при перемешивании в течение 20–
30 мин с повышением температуры до 60°С. Полученная масса разва-
ривается при 130°С с выдержкой 15 мин (нагревательная колонка + 
выдерживатель). Разваренная масса охлаждается в теплообменнике 
типа «труба в трубе» до 60°С и подвергается осахариванию ячменным 
солодом в течение 10–15 мин. Осахаренная масса направляется на 
стерилизацию (нагревательная колонка + выдерживатель) при темпе-

90 
ратуре 120–123°С в течение 15 мин и после охлаждения поступает 
в ферментатор. 
Рис. 8.2. Приготовление и стерилизация питательной среды: 1 – шнековый
смеситель; 2 – емкостный смеситель; 3 – фильтр сетчатый; 4 – нагревательная 
колонка; 5 – выдерживатель; 6 – холодильник; 7 – осахариватель 
Производственную ферментацию осуществляют в условиях асеп-
тики при температуре 32°С в течение 5–6 сут. Расход воздуха на аэра-
цию среды в ферментаторе – 50 м
3
/(м
3
·ч). Культуральную жидкость 
хранят в сборниках в захоложенном состоянии (12–15°С) без суще-
ственных потерь активности до 200 ч. КЖ может быть реализована 
как ферментный препарат глюкаваморин Гх. Для получения препарата 
с индексом Г2х отделяют биомассу гриба фильтрованием на фильтре-
прессе ФПАКМ, фильтрат концентрируют с одновременной очисткой 
от низкомолекулярных примесей на ультрафильтрационной установке 
с получением жидкого концентрата амилаз (активность 800–
1000 ед./дм
3
). Продукт стабилизируют введением консерванта 
(например, бензойнокислого натрия). 

жүктеу/скачать 1,87 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: