Микробиология
жүктеу/скачать 5,08 Mb. Pdf көрінісі
|
BulashevAK BMB.pdf
| Дақтардың түзілуін анықтау әдісі
вирустарды титрлеуде, вирустардың таза популяциясын алуда және олардың генетикалық қасиеттерін анықтауда кеңінен қолданылады. Бҧл әдіс қҧрамында нейтральрот бояуы бар агармен қапталған дара қабаттарында (вируспен зақымдалған жасуша ӛсінділерінің) дақтардың немесе негативті колониялардың пайда болуына негізделген. Дақтар вирустардың әсерінен ӛлген жасушалардан тҧратын, ӛсінділердің тҥссізденген учаскесі. Вирустардың бір орыннан екінші бір жерге ауысуына жол бермеу мақсатында пайдаланылатын агардың орнына крахмал мен метилцеллюлозаны да қолдануға болады. Кӛптеген ғалымдар бҧл әдісті жылқылардың энцефаломиелиті, аусыл, везикулярлы стоматит, ірі қара обасы, қҧс обасы, Ньюкасл ауруы, полиомиелит, шешек вакцинасы Коксаки вирустары мен кейбір герпес вирустардың ӛкілдерін зерттеуде қолданған. Дақтардың тҥзілу әдісін қоюда қолданылатын жасуша ӛсінділерінің сапасы жақсы, жасушалар біркелкі және дегенерацияланбаған болуы керек. Қоректік ортамен немесе Хенкс ерітіндісімен шайылған жасушаларға қажетті сҧйылтымдағы вирусы бар материалды қҧйып, жасуша мен вирустың бір-бірімен байланысқа тҥсуін қамтамасыз ету ҥшін нақты бір уақыт аралығында (1-2 сағат) +37-38ºС температурада ҧстайды. Сонан соң жасушаларға адсорбцияланбаған вирустарды Хенкс ерітіндісімен шайып тастайды да, дара қабатты жасушалардың бетін арнайы агар ерітіндісімен қаптайды. Жасуша беткейін қаптауға арналған ортаны вирустардың тҥріне қарай таңдайды. Арнайы орта компоненттері: агардың 2,5%-ды ерітіндісі – 90 мл; Эрл ерітіндісі (10 Х концентраты) – 18 мл; бидистилденген су – 60 мл; бҧзау қан сарысуы – 3,6 мл; бейтарапты қызыл (1:1000), сода ерітіндісі (NaHCO 3 ) – 5,4 мл; пенициллин (100000 ӘБ/мл) – 0,18 мл; стрептомицин (100000 ӘБ/мл) – 91 0,18 мл. Барлық компоненттерді +45-50ºС температурада араластырады да, ортаның температурасын +36-38ºС-ге дейін салқындатып, жасуша дара қабатының беткейін қаптайды. Агар қатқаннан кейін ондағы конденсацияланған ылғалды тӛгіп, матрасты (флаконды) аударылған кҥйінде термостатта инкубациялайды. Инкубация уақыты мен температурасы зерттеуге алынған вирустың дақтарды тҥзуіне сәйкес болуы қажет. Дақтардың тҥзілуін бірнеше тәулік бойы бақылап отырады. Осы уақыт аралығында жасушаға адсорбцияланған вирустар жасуша ішіне еніп, репродукцияланғаннан кейін шығады да кӛрші жасушаларды зақымдайды. Бірыңғай орналасқан тірі жасушалар арасында вирустардың репродукциялануының әсерінен ӛлген жасушалардан қҧралған дақтар кӛрінеді. Қолданылған бояу ерітіндісімен тек тірі жасушалар қызғылт тҥске боялады. Сондықтан матрастағы бірыңғай қызыл тҥсті аяда (фон) тҥссіз дақтар пайда болады. Дақтардың пайда болуы уақыты мен морфологиясы вирустың тҥріне, штамына, жасушалардың типі мен оларды ӛсіру жағдайына байланысты болады. Жасуша ішінде ерекше қоспалардың (денешіктердің) түзілуін айқындау. Кӛптеген вирустық ауруларға ҧшыраған жануарлардың органдары мен ҧлпаларының жасушаларында (цитоплазмада немесе ядрода) ерекше қоспалар – денешіктер пайда болады. Ерекше денешіктер жасушада жиналуына, нуклеин қышқылының қҧрамына, тинкториальдық қасиеттері мен гомогендігіне қарай жіктеледі. Ондай денешіктер шешек, тҧмау, қҧтырық, парагрипп және т.б. вирустық ауруларда жасушалардың цитоплазмасында орналасса, ал ірі қара ринотрахеиті, қҧс ларинготрахеиті, аденовирустық, т.б. инфекцияларда денешіктер жасушалардың ядросында пайда болады. Вирус денешіктерін анықтауға арналған препараттарды дайындау ҥшін жҧқтырылған жасуша ӛсінділерін шыны тҥтіктерге немесе флакондарға салынған жапқыш шыныларда ӛсіріп, зерттеуге алынған вирустық материалдармен жҧқтырады да, белгілі бір уақыт аралығында +37ºС-де инкубациялайды. Инкубация уақыты аяқталғаннан кейін шыныларды алып, жылытылған Хенкс немесе физиологиялық ерітіндімен (рН 7,0-7,2) шайып, сҥзгіш қағазбен кептіргеннен кейін арнайы қоспалардың бірімен бекітеді: Буэн ерітіндісінде – 10-15 минут, Карнуа бекіткішінде – 10 минут, Ценкер ерітіндісінде – 20-30 минут, метил спиртінде – 10 минут. Сосын препараттарды тҥрлі әдістермен бояйды. Гематоксилин-эозинмен боялған препараттардан вирус денешіктері айқын кӛрінеді. Ол ҥшін жапқыш шыныға бекітілген жасушаларды дистилденген сумен шайып, 10-15 минут бойы гематоксилин (Майер, Эрлих, Карацци, т.б) ерітіндісімен ӛңдейді. Сонан соң препаратты сумен шайғаннан кейін 1-2 минут аммиакты суда (200 мл дистилденген су + 3 тамшы аммиак) ҧстайды. Сілтілі орталарда жасуша ядросы кӛк тҥске боялады. Сонан соң препаратты эозиннің 0,1%-ды судағы ерітіндісімен 92 30-60 секунд бояп, сҥзгіш қағазбен қҧрғатқан соң спирттің концентрациясын бірте-бірте арттыра отыра ӛңдейді: 70, 80, 96, 100º+ксилол (1:1), ксилол. Препаратты әрбір спирт пен ксилолда 1 минутқа дейін ҧстайды. Әрбір сҧйықтыққа ауыстырар алдында препаратты міндетті тҥрде сҥзгіш қағазбен сорықтырып отыру қажет, әйтпесе спирт суланып кетеді. Гемотоксилин-эозинмен жасуша ядросы – кӛк тҥске, цитоплазмасы – қызғылт, ал денешіктер вирустардың тҥрлеріне қарай кӛк немесе қызғылт тҥске боялады. Қан, жілік майының жасушаларын немесе лимфоидты мҥшелерден алынған жасуша ӛсінділерін бояуда Романовский-Гимза әдісін қолданады. Вирусология тәжірибесінде вирус денешіктерін анықтау ҥшін жасушалардан дайындалған препаратты қызғылт сары тҥсті акридинмен флуорохромдау әдісі жиі қолданылады. Флуорохромдау әдісіне арналған препараттарды екі жолмен дайындауға болады: а) патологиялық материалдардан немесе жҧқтырылған жасуша ӛсінділерінің суспензияларынан дайындалған жағындыға 1-2 тамшы қызғылт сары тҥсті акридиннің 1:10000 қатынасындағы ерітіндісін тамызады да, бетін жапқыш шынымен жабады. Дайын препаратты 10-20 минуттан кейін лиминесцентті микроскоппен қарайды; ә) мҧнда жағындыны 15-30 минут бойы 96º этил спиртімен бекітіп, Хенкс ерітіндісімен шаяды да, оған 1-2 тамшы қызғылт сары тҥсті акридинн ерітіндісін тамызып, бетін жапқыш шынымен жапқаннан кейін зерттейді. Осы тәсілдермен боялған препараттардағы жасуша ядросының ДНҚ жасыл тҥсті асыл тас тәрізді, ал цитоплазма РНҚ қызыл немесе қызғылт сары тҥске боялады. ДНҚ-ды вирустармен (аденовирустар) зақымдалған жасушалардың ядросындағы гранулалаланған денешіктер жарқыраған жасыл тҥсті болып кӛрінеді. РНҚ-ды вирустармен (тҧмау) зақымдалған жасуша цитоплазмаларындағы вирустық материалдар ашық-қызыл тҥсті гранулалар кҥйінде байқалады. Жасушаның ДНҚ мен РНҚ-нан вирус денешіктерін ажырату ҥшін препаратты рибонуклеаза немесе дезоксирибонуклеаза ферменттерінің 0,5%-ды ерітіндісімен 10-15 минут ӛңдейді немесе ультракҥлгін сәулелерімен сәулелендіреді. Бҧл жағдайда жасушалардың ДНҚ мен РНҚ-ның жарқырауы жойылып кетеді, ал вирустық денешіктер 20-30 минутқа дейін жарқырайды. Вирустарды иммунды флуоресценция реакциясы (ИФР) және иммунды ферменттік талдаумен (ИФТ) анықтау әдістерін жасуша ӛсінділеріндегі вирустардың цитопатогендік әсері мен гемадсорбция қҧбылысы байқалмаған жағдайда қолданады. ИФР-да флуорохроммен таңбалан телімді антиденелер, ал ИФТ-да пероксидаза ферменттерімен таңбалан антиденелер пайдаланылады. (Бҧл әдістер туралы мәліметтер 120-125 беттерінде толық кӛрсетілген). 93 Вирустардың интерференциясына негізделген әдіс. Бҧл әдіс бір вирус екінші вирустың кӛбеюін тежейтін процесті анықтауға бағытталған. Мысалы, шошқаның оба вирусы аусыл вирусының, ал ньюкасл ауруының қоздырғышы везикулярлық стоматит вирусының инфекциялық белсенділігін тӛмендетеді. Әдетте аталмыш әдісті жасуша ӛсінділерінде цитопатогендік әсерді тудырмайтын вирустарды анықтау жҧмыстарында пайдаланады. Жасуша ӛсінділеріндегі шошқаның оба вирусын (ЦПӘ тудырмайды) анықтау ҥшін оған екінші бір вирусты (аусыл) жҧқтырып, +37ºС температураға реттелген термостатта бірнеше кҥн инкубациялағаннан кейін микроскоппен зерттейді. Егер жасуша ӛсінділерінде ЦПӘ байқалмаса, онда шошқа обасының вирусы бар деп есептеледі. Ал жасушаларда ЦПӘ байқалса, онда шошқа обасының вирусы жоқ деп саналады. Бҧл жағдайда жасушалардағы ЦПӘ аусыл вирусының әсерінен болады. Сонымен қатар интерференция әдісін жасуша ӛсінділерінде ЦПӘ тудырмайтын вирустарды титрлеу жҧмыстарында да пайдаланады. жүктеу/скачать 5,08 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|