Белоктардың ионалмасушы хроматографиясы

83
Көптеген ионалмастырғыш түрлері бар, алайда белоктарды бөлу 
үшін тек кейбіреулері ғана жарамды, ионизация деңгейі бойынша 
əлсіз зарядталған тобы ретінде диэтиламиноэтил (ДЭАЭ) немесе кор-
боксилметил (КМ) жатады. Белок хроматографиясы үшін мықты 
зарядталған топтарды қолданбайды, өйткені оларда белокты байланы-
стыру күштері едəуір болып келеді, əрі элюция (сұйылту) үдерісі бе-
лок денатурациясын тудыратын ерекше қатаң шарттарды қолдануды 
талап етеді. Белок хроматографиясы үшін гидрофобты қасиеттері бар 
сорбенттерді қолданбайды, өйткені бұл жағдайда кенеттен су мен 
қатты дене бөлімінің беті жүзімді, онда белок қарқынды денатурация-
лаушы əсерлерге тартылады. Осының бəрі белоктың ионалмастырғыш 
хроматографиясына сорбенттердің аздаған таңдауын шарттастырды.
Белоктардың хроматографиясы үшін тиімді ионалмастырғыш 
ДЭАЭ-мен КМ-целлюлозалы сорбенттер болып табылады. Белок хро-
матографиясы үшін целлюлозалы ионалмастырғыштарды 1956 жылы 
E. Петерсон мен Х. Собер ұсынған болатын. Дегенмен одан бері белок 
хроматографиясы үшін басқа да тасымалдаушы ионалмастырғыштар 
пайда болды. ДЭАЭ- мен КМ- целлюлозалы сорбенттер белоктарды та-
залауда алдыңғы орынды алады, целлюлозалы тасымалдаушылардың 
артықшылығы: олар «сефадекс» гелі негізіндегі ионалмастырғыштарға 
қарағанда көлемін аз өзгертеді, сонымен қатар целлюлозалы 
талшықтардың құрылымының қаттылығы талшықтар бетінде ғана 
белоктардың макроиондарының сорбциясын ескертеді, осылайша 
маманданбаған сорбция үдерістерін болдырмайды да, элюция кезінде 
(recovery) ионалмастырғыштан белоктың толық қайтуын қамтамасыз 
етеді. ДЭАЭ-целлюлозалы карбоксильді топтары бар қышқыл теріс 
зарядталған белоктарды бөлу үшін қолданылады. 
2.4-суретте 
ионалмасушы 
хроматографиясының 
мысалы 
көрсетілген.
КМ-целлюлоза – катионит жəне қышқыл қасиеті бар функционалды 
топ. Бұл ионалмастырғыш негізгі қасиеті бар белоктарды бөлу үшін 
қолданылады. Белок заряды оның изоэлектрлік нүктесімен (ИЭН) жəне 
буфермен (онда белок ерітілген) анықталатындығын естен шығармау 
керек. Мысалы, ИЭН 7,5 болатын белок рН-ы 8,5 буферлі ерітіндіде 
əлсіз теріс зарядқа ие болады, ал ИЭН 6,0 болатын белок рН-ы 4,0 
буферде əлсіз оң болады, яғни белоктың теріс жəне оң зарядтары 
радикалдардың ионизация дəрежесімен де анықталады. Сондықтан 
əлсіз теріс зарядталған белоктар КМ-целлюлозаға жəне, керісінше, 

84
2.4-сурет. Ионалмасушы хроматографиясының мысалы: а-в – бағананың 
жүктемесі: қозғалыс аниондар (немесе катиондар) катиондардың 
(немесе аниондардың) қасында жиналады, олар сорбентке (қозғалыссыз 
фаза) ковалентті байланыспен байланысады; г-е – тұздың градиентімен 
бағананы сұйылту: тұздың иондарын үлгі иондары мен сорбент 
иондарының электростатикалық өзара іс-қимылы əлсіретеді; əртүрлі 
электростатикалық қасиеттері бар үлгіні молекулаға əртүрлі тұздың 
концентрациясымен сұйылтады, əдетте, 0-2 М; ж – үлгіні молекулар 
сорбентке тігілген иондармен өзара іс-қимылы: анықтама рН мəні жəне 
тұздың төмен концентрация жағдайында осы мысалдарда көрсеткен үш 
типті бөліну керек биомолекулалардың көбірек қозғалыссыз фазаның 
иондармен кайталама байланысады (Б. Нолтинг, 2005)
əлсіз оң зарядталған белоктарды ДЭАЭ-целлюлозаға бөлуге болады, 
тек буферлі ерітіндіні дұрыс таңдау керек. Осы себептерге байланыс-
ты белок элюциясы əдістерінің бірі – ДЭАЭ-целлюлоза үшін рН-тың 
біртіндеп төмендеуі мен КМ-целлюлоза үшін оның біртіндеп өсуі. 
Сонымен қатар ионалмасудың сыйымдылығын өсіру үшін белокты 
ДЭАЭ-целлюлозаға рН-тың жоғары мəндерінде, ал КМ–целлюлозаға 
төмен мəнінде болады. 
Целлюлозалы ионалмастырғыштарда тиімді жұмыс үшін, соған 
қарасты буферлік ерітіндіні қолдану керек, онда ион алмасу үдерісіне 

85
қатыспайтын жəне ионалмастырғыштың функционалды тобымен 
əрекеттеспейтін буферлік ионы болу керек, яғни ДЭАЭ-целлюлоза 
үшін əлсіз негізбен түзілген буферлік ерітінділерді пайдалану керек, 
мысалы, трис, имидозол, аммоний, триэтанол, т.б., ал КМ-целлюлоза 
үшін ацетатпен, фосфатпен, цитратпен жəне т.б. түзілген буферді 
қолдану керек. 
Қарсы ион ретінде ДЭАЭ үшін хлор ионын, ал КМ-целлюлоза 
үшін натрий ионын қолданған жөн. Олармен тұзды формаларды 
зарядталған ионалмастырғышпен ауыстыру керек, бұл зарядталған 
ионалмастырғышты сорбциялауды ескертеді, осылайша мамандан-
баған сорбция үдерісін болдырмайды. Элюция кезінде (recovery) 
ионалмастырғыштан белоктың қайтуын қамтамасыз етеді. ДЭАЭ-
целлюлозалы карбоксильді топтары бар қышқыл теріс зарядталған 
белоктарды бөлу үшін қолданылады. Мысалы, ДЭАЭ-целлюлозалар 
трис-НСl буферінің көп көлемімен шайылады, бұл элюент рН-ы ша-
ятын буфер рН-ына тең болғанша жүргізіледі. Тек осыдан кейін ғана 
ионалмастырғыш жұмыс істеуге даяр болады.
Сорбенттің адсорбциялық қасиеті бөлінетін белоктардың рН-ына 
жəне изоэлектрлік нүктесіне (ИЭН) едəуір тəуелді болады (2.3-кесте). 
2.3-кесте
Кейбір маңызды алмастырушылардың қасиеттері 
[Б. Нолтинг, 2005] 
Функционалды топтар
Алмасушының түрі
рН межесі
─N
+
─CH
3
Төртінші амин (күшті анион)
1-11
─NH
2
Бірінші амин (əлсіз анион) 1-8
NH
Екінші амин (əлсіз анион)
1-7
─N
Үшінші амин (əлсіз анион)
1-6
─COO
-
Көмірқышқыл (əлсіз катион)
6-14
─SO
3
-
Сульфоқышқыл (күшті катион)
1-14
Ақырында, ионалмастырғышты сүзумен немесе бейтарап рН эле-
ментке дейін су деионтациясымен жуады. Осылайша, қолданылған 
ионалмастырғыштарды көбірек қалпына келтіруге болады.
КМ-целлюлоза үшін зарядтың жүру тəртібі керісінше болады. Ал-
дымен сілтімен өңдеу, содан соң шайылғыш элюент рН-ын 8,0-ге дейін 

86
жеткізу жəне соңында НСl-мен өңдеу, бейтарап реакцияға дейін жуу. 
ДЭАЭ-целлюлозамен жұмыс жасағанда, ионалмастырғыш ауданы 
көмірқышқыл газымен əсерлеспеуі керек, ДЭАЭ топ газбен ДЭАЭ-
карбонаттар мен бикорбонаттар түзеді, бөлінуді кенет өзгертуі жəне 
əдістің орындалуын бұзуы мүмкін. Мұны болдырмау үшін гель мен 
барлық ерітінділердіні ауасыздандыру (дегаздау) керек.
Дайын гельді жағу техникасы. Толтырылған бағананы бастапқы 
буфермен шаяды да, үлгіні жағады, сосын элюцияны бастапқы бу-
фермен жалғастырады (онда белок ерітілген). Жиналған фракция-
ларда белок құрамын анықтайды, элюцияны элюатта белок табыл-
майынша жалғастырады; тек осыдан кейін ғана ионалмастырғышпен 
байланысқан белоктарды бөліп алу үшін ионды күштің біртіндеп неме-
се сатылы өсуімен немесе рH өзгеруі мен буфер ерітіндісінің градиентін 
жəне сатылы элюцияны қолдануға болады. Белокты қоспалардың 
тиімді бөлінуі үшін ұзын емес, қысқа бағаналарды пайдаланған дұрыс 
жəне үлкен көлемді жоғары градиенттерді беру керек. Сатылы элюция-
да əрбір сатыны белокты толығымен алғанша жүргізу керек, содан 
кейін ғана оны келесі сатыға бере аламыз.
Ионалмасушы хроматография кезінде белок элюциясының 
үздіксіз бақылануы қажет, спектрдің ультракүлгін бөлігіндегі элюат 
экстинкциясының автоматты тіркеуін мүмкіндігінше пайдалану ке-
рек. Бөлу үдерісінің аяқталуынан кейін қайта қолдану үшін бағананы 
NACl 1 M ерітіндісімен алады да, бастапқы буфермен теңестіреді. 
Ионалмастырғышты пайдалану мөлшеріне қарай үстіңгі қабатты 
қайтымсыз байланысқан заттармен біртіндеп шешіп алады. Бағананы 
тазарту үшін, NACl-дың қаныққан ерітіндісімен жуады, шаяды.
Кейбір жағдайларда «батч» əдісі, қарапайым ионалмастырғышты 
қосып, белокты өңдеу қолданылады, 1 сағат араластырады да, 
ионалмастырғышты сүзу немесе центрифугалау арқылы жояды. Бұл 
жағдайда балласты белоктарды байланыстыру үшін ионалмастырғыш 
пайдаланылады.
Целлюлозалы ионалмастырғыштан басқа, сефадекстер негізіндегі 
ионалмасушы сорбенттер қолданылады. «Фармация» (Швеция) фир-
масы ДЭАЭ мен КМ – сефадекстердің А жəне С типіне сəйкес анионды 
жəне катионды алмастырғыштармен белгіленетін түрлерін шығарады. 
Бұл фирма ДЭАЭ жəне КМ СЕ-GВ сефарозаларды өндіреді, олар 
жоғары молекулалы белоктарды бөлуге өте ыңғайлы, ионды емес де-
тергенттер кезінде де жұмыс жасауға қабілетті. 

87

жүктеу/скачать 5,04 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: