Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер
Хлоропластты жəне митохондриялық ДНҚ-ны бөліп алу
жүктеу/скачать 5,04 Mb. Pdf көрінісі
|
Kenzhebayeva (1) (1) (1)
| 3.6. Хлоропластты жəне митохондриялық ДНҚ-ны бөліп алу
Жалпы мағлұматтар. Органеллалардан ДНҚ-ны бөлу ядролық ДНҚ-ны бөліп алу əдістеріне ұқсас келеді. Органеллалардан ДНҚ-ны бөліп алудың сызбанұсқасы бірнеше сатыдан тұрады: 118 1. Хлоропластар мен митохондриялардың мембраналары біртұтас болған жағдайда клеткалық мембрананың жұмсақ бұзылуы. 2. Центрифугалау арқылы ядролық, хлоропласты жəне митохон- дриялық бөлiкшелерді: төмен жылдамдықты центрифугалау көмегімен (500 айналымда (g) клеткалық дебристер мен ауыр ядроларды бөліп алу; орташа жылдамдықты центрифугалау (5000 айналымда (g) хлоропластарды тұнбаға түсіру; жоғары жылдамдықты центрифугалау (10000 айналымда, g) көмегімен митохондрияларды тұнбаға түсіру. 3. Ядролық ДНҚ-ны қоспалардан тазалау үшін алынған хлоро- пластар мен митохондрия препараттарын ДНҚазамен өңдеу. 4. Органеллалардың лизисі; хлоропласты жəне митохондриялық ДНҚ-ны бөліп алу жəне тазалау. ДНҚ-ны органеллалардан бөліп алудың бірнеше тəсілі бар. Өте жиі центрифугалау арқылы ДНҚ-ны хлоропластар мен митохондрия- лардан сахароза мен перколла градиенттерінде бөліп алу əдістері қолданылады. Бұл – көп еңбекті, ұзақ уақытты қажет ететін əдістердің бірі. Дегенмен мүмкін болатын ДНҚ қоспалары ең төменгiсi түрде бо- лады. Мұндай сападағы хлоропласты жəне митохондриялық ДНҚ-ны, əдетте, органеллалардың нақты бір гендерін клондау кезінде, пластидті жəне митохондриялық геномдар кiтапханасын алуда пайдаланады. Хлоропласт пен митохондрия ДНҚ-ларын рестрикциялық талдау кезінде, молекулалық талдау барысында полимеразалық тізбектік реакция негізінде оны матрица ретінде қолданғанда, ядролық ДНҚ- ның мүмкін болатын қоспалары нəтижелерге мəндік əсер етпейді. Біз қарапайым жəне жылдам əдісті ұсынып отырмыз. Бұл əдіспен ДНҚ-ны органелладан бөліп алғанда, үлгілер ядролық ДНҚ-ның қоспаларын құрайды, алайда бұл хлоропластар мен митохондриялар геномына молекулалық талдау жүргізуге кедергі келтірмейді. Жұмыс жасау барысы. Органеллаларды бөліп алу. Хлоропластар мен митохондрияларды бөлмес бұрын 10-күндік жасыл өскіндерді қараңғыда полисахаридтердің мөлшерін азайту үшін 2-3 күн ұстайды. Содан соң 5 г өсімдік материалын алып, дистильденген сумен шайып, сүзгi қағазбен кептіреді. Қайшымен ұсақтап, салқындатылған келіге салады. Келесі операцияларды мұзды моншада жүргізеді. Өсімдік материалын 20 мл жаңадан дайындалған буфер І гомогенизациялай- ды. Буфер келесі заттардан тұрады: 300 мМ сахароза, 50 мМ Трис (рН 7,8); 10 мМ ЭДТА (pH 8,0); 0,1%-ті БСА (бұқаның сарысу альбумині); 0,2% 2-меркаптонол. Хлоропластты жəне митохондриялық ДНҚ-ны 119 бөліп алу үшін гомогенизаторда гомогенизациялайды (2-3 сатыда 30 с сайын 1 мин бойы). Гомогенизациядан кейін материалды тығыз ней- лон арқылы фильтрлейді. Фильтрлеу үшін су ағызатын сорғы мен кең Бюхнер шұңғымасын пайдаланған ыңғайлы. Алынған фильтратты 300 айналымда (g) 20 мин бойы центрифугалайды. Нəтижесінде ядро мен клеткалық дебрис тұнба түзеді. Тұнбаүстілік фракцияны жаңа түтiкке ауыстырып, 4000 айналымда 20 мин бойы хлоропластар тұнбаға түсу үшін центрифугалайды. Құрамында митохондриясы бар тұнбаүстілік фракцияны таза түтiкке құйып алады. Хлоропластар тұнбасына 10 мл буфер І қосады, ақырын ресуспендирлейді де, қайтадан центрифуга- лайды. Алынған тұнбада интакты хлоропластар болады. Митохондриясы бар тұнбаүстілік фракцияны 10000 айналымда (g) 30 мин бойы митохондрияны тұнбаға түсіру үшін центрифугалайды. Органеллалардың лизисі мен хлоропласты жəне митохондриялық ДНҚ-ны бөліп алу. Интакты хлоропласт пен митохондриясы бар тұнбаны 500 мкл буфер II ресуспендирлейді, буфер ІІ келесі зат- тардан тұрады: 100 мМ Трис (рН 7,5); 25 мМ ЭДТА; 200 мМ NaCl; 0,1%-ті 2-меркаптонол, 1%-ті SDS. Ядролардың толық лизисі үшін ерітіндіні 65°С 15-20 мин бойы инкубациялайды. Фенол мен хлоро- форм қоспасының тең көлемін қосады, гомогенді эмульсия түзілгенше араластырады. 12000 айналымда (g) 5 мин бойы центрифугалайды. Су фазасын жаңа түтiкке жинап алып, фенол мен хлороформ қоспасымен депротеинизацияны қайталайды. Су фазасын іріктеп, оған 5 М натрий ацетатының 1/10 бөлігін қосады да, араластырады. Салқын изопро- пил спиртін қосып ДНҚ тұнбаландырады. 1 сағатқа -20°С қалдырады. 12000 айналымда (g) 30 бойы центрифугалайды. Тұнбаүстілік сұйықты төгіп тастайды да, тұнбаны бірнеше рет 300 мкл 70%-тік этанолда ша- яды. Тұнбаны кептіріп, дистильденген суда немесе ТЕ-буферде ерітеді. Бұл буфер 10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА құрайды. Хлоропласты жəне митохондриялық ДНҚ ерітінділерін -20°C-та сақтайды. Алынған ДНҚ 5 рестрикциялық талдауы жəне 50 ПТР (ПЦР) өткізу үшін жеткілікті болады. жүктеу/скачать 5,04 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|