Бактериалды клеткалардан сілтілі əдіспен плазмидті

120
хромасомды емес, сақиналы екі тізбекті ДНҚ молекуласы болуы 
мүмкін, олар плазмидтер деп аталады. 
Плазмидтердің ұзындығы 1-ден 500 мың нуклеотидтерден 
құралады. Плазмидтер автономды түрде бактерия клеткасында ре-
пликацияланады, бұл оның ерекше орналасқан репликацияның баста-
лу орны болуымен түсіндіріледі. Көптеген плазмидтер антибиотик-
ке тұрақты генді немесе ерекше метоболиттердің синтезіне жауапты 
генді тасымалдайды. 
Генотипке байланысты бактериалды клеткада бірден беске дейін 
(төмен көшірмелі плазмидте), бірден екі жүзге дейін (жоғары көшірмелі 
плазмидте) плазмидтердің көшірмесі болуы мүмкін. Жоғары көшірмелі 
плазмидтер жағдайында олардың санын жасанды түрде көбейтуге бо-
лады. Көптеген плазмидтерде бірнеше иесі болады, түрлі бактериялар 
клеткасында көбейе алады. 
Сонымен қатар кей плазмидтер белгілі бір дəрежеде сыйымдылыққа 
ие, олардың геномына бөтен ДНҚ-ның бөліктерін енгізуге бола-
ды (ұзындығы ондаған метрден мыңдаған метрге дейін). Оларды 
өзінікіндей қабылдап, олармен репликациялана алады. Мұндай плаз-
мидтер ген инженериясында ДНҚ фрагметтерін клондау үшін вектор 
ретінде қолданылады. 
Қандай да бір ген инженериялық конструкцияны алу сатысында 
плазмидті векторды клондау міндетті болып табылады. Сондықтан 
плазмидті ДНҚ-ны бөлу генетикалық инженерияда кең қолданылады. 
Плазмидті ДНҚ-ны бөлу əрекетін үшке бөлуге болады. 
1. Бактериалды клеткаларды бұзу (лизис).
2. Плазмидті ДНҚ-ны бактериалды хромасом ДНҚ-дан бөлу.
3. Плазмидті ДНҚ-ны тазалау.
Клеткалардың лизисі сəйкес лизистеуші ерітіндіні қосу көмегімен 
іске асады, оны қосқанда бактериалды мембрананың үзілуі бола-
ды. Плазмидті жəне хромосомды ДНҚ-ны бөлу негізіне олардың 
көлеміндегі айырмашылықтары жатады. Молекулалардың құрамында 
гидроксид натрий жəне жоғары молекулалы детергент SDS көмегімен 
денатурациялағанда, бұл айырмашылық тереңдей түседі. NaOH 
əсерінен екі тізбекті молекулалар бөлінеді. Мұнда қысқа молекулалы 
сақиналы плазмидтер байланысқан күйі болады жəне екі сақиналы 
байланысқан типті құрылымдарды түзеді. SDS алынған бактериалды 
хромосом молекулаларын жəне бактериалды ДНҚ-ны да орап алады, 

121
нəтижесінде ұзын бактериалды ДНҚ молекулаларымен ауыр детергент 
молекуласының көп мөлшері байланысады. Калий ацетатын қосқаннан 
кейін молекула ДНҚ-ы ренатурацияланады, мұнда плазмидтің 
сақиналы молекулалары жылдамырақ ренатурацияланады. Бұл саты-
да бактериалды жəне плазмидті ДНҚ-ны центрифуга көмегімен оңай 
бөлуге болады. Бұл кезде плазмидті ДНҚ-ның сақиналы молекулалары 
ерітіндіде болады. 
Плазмидті ДНҚ-ны белоктан тазарту оған фенол немесе хлороформ 
қосу арқылы жүргізеді, соның əсерінен белоктар коагуляцияланады 
жəне ерімейтін күйге түседі.
Жұмыс жасау барысы: мұзды моншада мұздатылған 1,5 мл түнгі 
дақылды түтiкке ауыстырады, үш минут 12000 айналымда (g) центри-
фугалайды, супернатанттан тазартады, бактериалды клетка тұнбасына 
көлемі 200 мкл салқын лизирлеуші ерітіндіні қосады, құрамы: 25 мМ 
Трис (рН 8,0), 10 мМ ЭДТА, 50 мМ глюкоза. Тұнбаны суспензиялай-
ды жəне 20 мин көлемінде мұзды моншада инкубациялайды, құрамы 
0,2 NaOH жəне 1%-тік SDS денатурлеуші қосады (400 мл жаңадан 
дайындалған, мұзда салқындатылған). Түтiктің қақпағын жауып, тез 
аудару арқылы араластырады. 
Түтiкті 5 мин мұзды моншада қалдырады. Мұнда ерітінді 
мөлдірленіп жəне тұтқырлана түсуі керек. 300 мкл суық 5 мл калий 
ацетаты (рН 4,8) ерітіндісін қосады, сілкілейді жəне мұзды моншада 15 
мин көлемінде инкубациялайды. Он минут 12000 айналымда (g) цен-
трифугалайды. Супернатантты жаңа пробиркаға ауыстырады. Бірдей 
көлемдегі фенол хлороформ (1:1) қоспасын қосады. Алдын ала фенол-
ды айдайды жəне 0,1 М Трис-(рН 9)-пен қанықтырады. 2-3 мин сілкілеп 
жəне кейін 12000 айналымда (g) 5 мин центрифугалайды. Ұқыпты 
түрде беткі сулы фазаны алады. Операцияны интерфаза толығымен 
жойылғанша қайталайды. Сулы фазаға 5 М NaCl ерітіндісін қосады, 
соңғы 0, 3 М концентрацияға дейін, плазмидті ДНҚ-ны 2 көлемді 95%-
тік этанолды қосу көмегімен тұндырады. 10 мин көлемінде 12000 ай-
налымда (g) центрифугалайды. Тұнбаны сүзгi қағаз жолағы көмегімен 
кептіреді, кейін 20 – 50 мкм дистилденген сумен жəне құрамында 10 
мМ Трис (рН 8), 0, 5 мМ ЭДТА (рН 8), көмегімен ерітеді. 
Бұл тəсілмен алынған плазмидті ДНҚ реструкциялық талдау, гиб-
ридизация, нуклеотидтер реттілігін, сонымен қатар трансформация 
бойынша тəжірибелер үшін жарамды. 

122

жүктеу/скачать 5,04 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: