Агарозды гельдегі ДНҚ электрофорезі

132
4. ДНҚ-ның қоғамдық құрылысымен. ДНҚ бөлiктері, яғни 
бірдей молекулалық салмағы бар, бірақ қоғамдық құрылысы бойын-
ша əртүрлі, мысалы, сақиналы зақымдалмаған, сақиналы біртізбекті 
үзілісімен жəне сызықты ДНҚ молекулалары агарозды гельде əртүрлі 
жылдамдықпен жылжиды.
ДНҚ бөлiктерін агарозды гельден оңай бөлуге (элюирлеуге) жəне 
одан ары талдау жүргізіп қолдануға болады.
3.7-сурет. Электрофорезге арналған құрылғының үлгісі (үстіңгі көрінісі). 
1 – ДНҚ бөлiктерінің жылжыту бағыты; 2 – агарозды гель 
(Е.А. Калашникова и др. 2006)
Электрофорезді жүргізген кезде көбінесе көлденең пластинка 
түріндегі гельді қолданады. Оларды платформаға орналастырады жəне 
бұл кезде гель электрофорезді буфермен толық жабылуы керек. Элек-
трофорез үшін көлденең гельде əртүрлі кюветаларды пайдаланады 
(3.7-сурет).
Электрофорезді буферлі ерітінділерде жүргізеді. Көбінесе трис-
боратты буфер (ТББ) жиі қолданылады. Бұның құрамында: 0,09 М 
трис-борат (рН 8,0), 0,002 М ЭДТА немесе трис-ацетатты буфер (ТАБ), 
яғни оның құрамында 0,04М трис-ацетат (рН 8,0), 0,002М ЭДТА бар. 
ТББ-буфер ТАБ-буферге қарағанда үлкен буферлік көлемімен сипат-
талады жəне оны бірнеше рет қолдануға болады. ТАБ-буферді ДНҚ 
бөлiктерін бөліп алу үшін пайдаланады.
Жұмыс жасау барысы: Агарозды гельді дайындау. Электрофорезді 
буфердің өлшенген көлеміне агарозды ұнтақтың өлшенген мөлшерін 
қосады.

133
Агарозаның концентрациясын бөлінетін бөлiктердің ұзындығына 
байланысты таңдайды:
Гельдегі агарозаның мөлшері, % ДНҚ фрагменттерін тиімді 
бөлу аймағы, мың. ж.н.
0,3
60...5
0,6
20...1
0,7 
10...0,8
0,9 
7...0,5
1,2
6...0,4
1,5
4...0,2
2,0
3...0,1
Өлшенген агарозасы бар шыны сауытты агарозасы толығымен 
ерігенге дейін қыздырады (СВЧ-пешінде қыздыруға болады). Ыстық 
агарозды ерітіндімен жұмыс істегенде өте сақ болу керек. Ерітінді 
міндетті түрде түссіз болуы қажет.
Ерітіндіні ~50°С-қа дейін суытады жəне соңғы концентрациясындағы 
0,5 мкг/мл этидий бромның сулы ерітіндісін қосады (10 мг/мл). 
Алынған ерітіндіні арнайы электрофорезді моншаға құяды жəне 
қалташаны орналастырады. Гель толық қатқаннан кейін (бөлме темпе-
ратурасында 20-30 мин кейін) абайлап, қалташаны алып тастайды жəне 
гельді электрофорезді кюветаға орналастырады. Жеткілікті мөлшерде 
электрофорез буферін қосады (қажеттілігіне қарай оның құрамында 
0,5 мкг/мл этидий бромид болуы мүмкін) жəне гель 1-2 мм қабатты 
буфермен жабылуы керек.
Талданатын ДНҚ үлгісін енгізілетін үлгіге арналған арнайы бу-
фермен араластырады, содан кейін осы қоспаны буферлі ерітіндінің 
астындағы гельдің ұяшықтарына енгізеді. Үлгіні енгізуге арналған 
буфердің құрамында: 0,25%-дық бромфенолды көк; суда еріген 40%-
дық сахароза, 20мМ ЭДТА бар. Мысалы, 20 мкл талданатын ДНҚ 
үлгісіне 5 мкл үлгіні енгізуге арналған буферді қосып, 25 мкл көлемді 
ұяшықтарға құяды. ДНҚ молекулалардың қарапайым жиынтықты тал-
дау кезінде ұяшықтарға 0,2-0,5 мкг ДНҚ-ны енгізеді. Егерде үлгіде 
əртүрлі мөлшерлі ДНҚ бөлiктерінің өте үлкен саны болса, онда 
ұяшыққа 5-10 мкг ДНҚ енгізуге болады.
Агароздық гельдерде ДНҚ-ны бояу. Агарозды гельде ДНҚ-ны көзбен 
көру үшін ыңғайлы əдістердің бірі оны флуоресцентті бояғышпен, яғни 

134
этидий броммен бояу болып табылады. Бұл заттың молекуласының 
құрамында көрші ДНҚ негіздерінің арасында интеркаляцияланатын 
жалпақ топтар бар. 300 нм жəне 360 нм толқын ұзындықта бояғышпен 
сіңірілетін ультракүлгін сəуледен, содан кейін түсті спектрдің (590 
нм) қызыл-сары аймақтарынан өтеді. Егер этидий бромын гельге не-
месе электрофорездік буферге енгізсе, толқын ұзындығы 260-300 нм 
болатын ультракүлгін шамның астындағы үдерістерді бақылауға 
мүмкіндік туады. Электрофорезді бояғыш жоқ болған жағдайда да 
жүргізуге жəне бөлiктерді бөліп алғаннан кейін ДНҚ-ны бояуға бо-
лады. Бұл жағдайда гельді құрамында этидий бромы (0,5 мкг/мл) бар 
электрофорез буферіне 20 мин салып қояды. Этидий бром – өте күшті 
мутаген, сондықтан онымен жүргізілген барлық жұмыстарды міндетті 
түрде резеңке қолғаппен жүргізу керек.

жүктеу/скачать 5,04 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: