Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер
жүктеу/скачать 5,04 Mb. Pdf көрінісі
|
Kenzhebayeva (1) (1) (1)
| 4.1. Генді алу
Генді алудың үш əдісі бар: табиғи генді тікелей бөлу (сирек мүмкіндік), химиялық жəне ферменттік синтез. Табиғи генетикалық материалдан ДНҚ-дан арнайы ферменттердің (рестрикциялық эндонуклеазалардың) көмегімен қажет ген «кесіліп» алынады. Бұл əдістің елеулі кемшіліктері бар. Біріншіден, ДНҚ-дан кажет генді та- нып, кесе алатын ферментті таңдап алу қиын. Фермент генді əрқашанда нақты шекарасында емес əрқилы үзеді: 1. Не геннің екі жағынан артық нуклеотидтерді үзуі, не түгел үзбеуі мүмкін, мұндай ДНҚ фрагментерінің қызметі жеткіліксіз, сондықтан оларды пайдалану қиыншылық туғызады. 2. Эукариоттық организм геномының экзон-интрондық құрылысы, олардың гендерін бактерияларға енгізгенде функциялық түрғыдан 137 қиындық туғызады, өйкені бактериялық клеткада сплайсинг үдерісі (интрондардың кесілуі) өтпейді. 3. Егер ген барлық ДНҚ-ның аз ғана бөлігін құраса, онда оны бөлу мен анықтауда елеулі кқиындықтар пайда болады. Сондықтан бұл əдіс, негізінен, генетикалық тəжірибелер талабына сəйкес вирус пен бактериялардың генін бөлуде қолданылады. Берілген нуклеотидтер тізбегі бойынша ДНҚ синтездеу əдісін 1969 жылы, ген инженериясының дəуірі басталмаған кезде-ақ, Г.Корана ұсынған болатын. Ашытқы тРНҚ-ның гені осылай синтезделді. Бұл ген 77 нуклеиндік жұптан құралған. Алдымен, ұзындығы 5-12 ну- клеотидтерден тұратын ДНҚ-ның қысқа бөлiктері синтезделді, одан соң олар арнайы ферменттің (лигаза) əсерімен бір-бірімен қосылды. Алайда алғаш синтезделген бұл генді ішек таяқшасының клеткасы- на енгізген кезде жұмыс істей алмады, өйткені онда реттеуші эле- менттер – промотор жəне терминация бөліктері жоқ болатын. Кейін, 1976 ж. Г.Корана қызметкерлерімен тирозиннің тРНҚ-ның генін син- тездей алды. Генінің ұзындығы 126 нуклеиндік жұпқа тең болды, оған 52 нуклеиндік жұптан құралған апромотор, 21 нуклеиндік жұптан терминатор жəне ұштарына тетрануклеотидтер (ААТТ жəне ТТАА) жалғанды. Нəтижесінде, осы генді бактериофаг арқылы E. coli клетка- сына енгізгенде, олар өз қызметін көрсете алды. Генді синтездеудің ферменттік (энзимдік) əдісі. Генді синтездеудің үшінші əдісі кеңінен таралған жəне кейін рекомбинанты ДНҚ күйінде бір, кейде көп клеткалы организмдерде көбейетін гендердің негізгі шыгу көзі болып саналады. Оның мəні ферменттік синтез арқылы генді алудан тұрады жəне төмендегіге саяды. Ең алдымен клеткалар- дан (мұнда қажет геннің белсенділігі жоғары болуы керек) ақпараттық (матрицалық) РНҚ (аРНҚ) молекулаларын бөліп алады, олардың ара- сында ген кодтайтын аРНҚ бар, міне, осы иРНҚ-ны бөлу қажет. Бұдан кейін кері транскриптаза (ревертаза) ферментінің көмегімен бөлінген иРНҚ-да комплементарны ДНҚ (кДНҚ) синтезделеді. Кері транскрип- ция үдерісінде матрицалық аРНҚ-да кДНҚ-ның синтезі басталуы үшін аРНҚ-ның 3'-ұшына комплементарлы «ашытқы» – олигонуклеотид (қысқа тізбек) қажет. Жаңа кДНҚ тізбегі синтезделуі үшін тағы Мg 2+ иондары мен дезоксинуклеозидтрирафосфаттар керек. Жаңа кДНҚ синтезделіп біткеннен кейін, оны тазалап, ДНҚ-ның екінші тізбегін синтездеу үшін матрица ретінде пайдаланады. Ол үшін ортаға ревертазаны немесе ДНҚ-полимеразаны (бактериялардан 138 алынған) қосады. ДНҚ-ның екінші тізбегінің синтезі басталуы үшін олпгонуклеотид (ДНҚ-ның 3'-ұшына комплементарлы) керек, əйтпесе кДНҚ-ның 3'-ұшы белгісіз себептермен тіреуіш құрылым түзейді, осы құрылым екінші ДНҚ-ның синтезін инициациялай алады. ДНҚ-ның екінші тізбегі синтезделіп болғаннан кейін, оның алғашқы кДНҚ- ымен қосылған бөлігі (тіреуіш) нуклеаза S1 ферментінің əсері арқылы ажырайды. Нəтижесінде, қос тізбекті ген алынады, оны қос тізбекті комплементарлы ДНҚ (кДНҚ) деп атайды. РНҚ жіпшелері сілтінің əсерімен гидролизденеді, ал олигонуклеотидтер аталған нуклеазаның əсерімен ыдырайды. Кері транскриптаза ферменті арқылы синтезделген гендерді бак- терия клеткасына енгізбестен бұрын, оларга реттеуші элементтер жалғайды. Прокариоттарда сплайсинг өтпейтінін ескерсек, онда генді ферменттік жолмен синтездеу үшін матрица ретінде мРНҚ-ны емес, жетілген аРНҚ-ны пайдалану керек. жүктеу/скачать 5,04 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|