Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер

171
Гендерді генотекада плазмидалық рДНҚ түрінде (этил спиртінің 
тұнбасында), əсіресе рекомбинантты лямбда фаг суспензиясы түрінде 
(температурасы 0°С тең антисептиктер бар ортада) сақтау өте ыңғайлы. 
Басқа жағдайда рекомбинантты фагтарды бактериялар клондарын-
да да сақтауға болады. Мұндай клондарды жаңа қоректік орталарға 
жиі ауыстырып отыру қажет. Аталған жұмыстардың көмегімен кез 
келген организмнің гендер жинағын алуға болады. Бұл жұмыстың 
қиындықтары көп, оларды əртүрлі зерттеушілер алуан əдістерді 
қолданып жеңуде. Қазіргі əлемнің жүздеген зертханаларында ген-
дер жинағы құрастырылды. Гендер жинағы ғылыми эксперименттік 
жұмыстарда жəне биотехнологиялық бағытта жиі қолданылады. 
Олар кез келген генді немесе бірден бірнеше генді бөліп алу көзі жəне 
молекулалық генетиканың əдістемелік құралының ажырамайтын 
бөлігі болып саналады.
Кері транскрипцияның ашылуы құрылымды гендердің жинағын 
құрастыруға мүмкіндік берді. Оларды гендерге сəйкестендіріп, ком-
плементарлы ДНҚ генотекасы ден атайды, өйткені кДНҚ еш уақытта 
қажет генге толық сəйкес келмейді, сонымен қатар онда қосымша 
тізбектер де бар.
Белгілі бір организмнің толық геномы клонын көбейту үшін, қажет 
гендер жинағының мөлшерін геномның молекулалық массасы (М) 
мен фрагменттің орта мөлшерін біліп жəне дəлдік деңгейді (Р) таңдап, 
анықтауға болады:
N = М(n-1n) – 1 – Р)
Кейбір организмдер үшін гендер жинағының мөлшері 4.2-кестеде 
берілген. 
4.2-кесте
Кейбір организм түрлері гендер жинағының əртүрлі ықтималдар 
деңгейіндегі мөлшері [Гердон и др., 1987]
Организм түрі
ДНҚ-ның 
молекулалық 
салмағы, М
Фрагмент-
тің орта 
мөлшері, Д
Р əртүрлі болғандағы /
жинақ мөлшері (N)
0,90
0,95
0,999
Ішек таяқшасы
2,8 10,9
8,5 10
6
720
940
1440
Ашытқы
1 · 10
10
1 · 10
7
2300
3000
4600
Дрозофилла
1,1 · 10
11
1 · 10
7
23000
30000
46000
Қоян
2 · 10
12
1 · 10
7
460000 600000
92000

172
Қоянның барлық геномын сипаттайтын гендер жинағын құрас-
тыру үшін, жоғары дəлдік деңгейде 920 мың клон қажет. Ген 
инженериясының классикалық нысаны – Е.cоli бактериясының гендер 
жинағын дайындау үшін анағұрлым аз клондар саны қажет, шамамен 
1,4 мың. Сүт қоректілердің геномы үшін ең долбарлы есеп бойынша 
800 мың
-1
млн клон санынан құралған гендер жинағы қажет.
Эукариоттық организмдердің гендер жинағын алу үшін, олардың 
барлық ДНҚ жиынтығын гидродинамикалық əдіс арқылы бөлiктерге 
бөліп, вирустарға енгізеді. 
Қажет генді барлық бактериялар салмағынан алу үшін, оларды 
қатты қоректік ортаға ауыстырады, мұнда бактерияның əрбір жеке 
клеткасы жеке ұрпақ береді, яғни бактериялық шоғыр түзіледі. Енді 
гендер жинағын, яғни əртүрлі клондар арасынан қажет генді табу 
керек. Бұл үдеріс скрининг деп аталады. Гендер жинағы аз болған 
сайын, одан қажет генді табу оңай. Комплементарлы ДНҚ клонын 
көбейту əдісі гендер жинағы мөлшерін азайтуға əкеледі, дегенмен 
мұның өзінде де қажет генді табу үшін арнайы əдістер қолданылады. 
Кең тараған əдістің бірі шоғырларды гибридизациялау деп атала-
ды. Ол үшін Петри табақшасындағы жағымсыз шоғырларға (рДНҚ-
сы бар бактериялар) нитроцеллюлозалы сүзгіні беттестіреді, мұның 
нəтижесінде ДНҚ молекулалары сүзгіге жабысады. Сүзгінің газонға 
сəйкес орны үлкен дəлдікпен мұқият белгіленуі қажет, мысалы, сүзгі 
мен оның астындағы газоны бар агарды бірнеше жерден инемен шан-
шиды. Бұдан кейін сүзгіні тез арада 0,5 М NаОН-пен өңдейді, одан соң 
бейтараптайды. Мұның нəтижесінде қос тізбекті ДНҚ молекулалары 
денатурацияланып, жеке тізбектерге ажырап, нитроцеллюлозамен бай-
ланысады. ДНҚ молекуласын нитроцеллюлозалы сүзгіде берік бекіту 
үшін оларды 80°С температурада қыздырады.
Ген скринингісінің келесі жауапты кезеңі – сүзгіні радиоактивті 
зондпен өңдеу. Шолғы (зонд) дегеніміз – іздеп жатқан ген бөлігінің 
азоттық негіздеріне комплементарлы кішігірім ДНҚ немесе РНҚ 
тізбегі. Шолғы əр уақытта радиоактивті изотопмен белгіленеді. 
Шолғыны синтездеу үшін геннің немесе белоктың, ең болмағанда, 
кішігірім бөлігінің нуклеотидтер тізбегі белгілі болуы керек. Олардың 
амин қышқылдар тізбегі бойынша жəне генетикалық кодтың көмегімен 
геннің бөлігін кодтайтын нуклеотидтер тізбегін оңай алуға болады. 
Алайда кодтың туылмалы (синонимділігін) екендігін ескеру қажет, 

173
сондықтан белоктың белгілі тізбегінің метионин жəне триптофан амин 
қышқылдары (олардың бір ғана кодоны бар) бөліктерінен синтетикалық 
олигонуклеотид синтезделеді. Генетикалық кодтың туылмалығына 
байланысты ерекше жалғыз шолғы синтездеу мүмкін болмаса (мыса-
лы, гендегі сер-сер-про-ала амин қышқылдар қатары əртүрлі оқылуы 
мүмкін – АГЦАГАГГАЦГА немесе АГТТЦГГГГЦГЦ), синтетикалық – 
сериясын немесе табиғи синтездеу қажет. Табиғи сүзгі ретінде қажет 
геннің функциясы жоғары өтетіні белгілі клеткадан əртүрлі жолдар 
арқылы алынған РНҚ-ны пайдалануға болады. Көпшілік жағдайда 
осындай РНҚ-дан кері транскрипция үдерісі арқылы алынған 
олигонуклеотидтік кДНҚ сүзгі ретінде жиі қолданылады.
Шолғы алынғаннан кейін рекомбинантты векторды талдауға 
кіріседі. Гендер жинағын бүкіл геномның немесе комплементарлық 
ДНҚ-ның) ДНҚ (РНҚ) шолғысымен тексереді. Шолғы тек өзіне ком-
плементарлы генмен ғана гибридизацияланады (байланысады). Мұның 
негізінде ДНҚ-ДНҚ-сүзгі немесе ДНҚ-РНҚ-шолғы гибридтерінің 
құрылуы жатады. Сондықтан шолғы бір тізбекті болуы жəне гибриди-
зация қолайлы жағдайда өтуі қажет: жоғары температура, ұзақ уақыт 
(шолғы өзінің ДНҚ-сын тауып үлгеруі үшін). Гибридизация іс-шарасы 
аяқталғаннан кейін шолғыны жуып, артық сүңгілерден тазалайды, 
өйткені шолғыға жабысқан артық сүңгілер күшті радиоактивтік орта 
түзіп, гибридизация нəтижесін бұзады. Қажет ген бар ДНҚ тізбегі 
сүңгімен байланысып, радиоактивті изотоп (фосфор немесе йод) түрінде 
таңбаланады. Оның орнын табу салыстырмалы түрде қарапайым: 
шолғыны рентген фотопленкасының үстіне басады, қажет экспози-
циядан соң (оның уақыты радиоактивтіліктің күшімен анықталады) 
фотопленканы шығарады. Шолғыдағы радиоактивті ДНҚ бар орын 
фотопленкада кішігірім қара дақ түрінде көрінеді. Осындай фотоплен-
када радиоактивті изотоппен таңбаланған генді жарықта түсірілген ізі 
арқылы табу əдісі радиоаутография деп аталады. Шолғыда дақтың ор-
нына қарай отырып, газоннан қажет рДНҚ енген жағымыз шоғырды 
табуға болады (4.13-сурет).
Сонымен, қажет гені бар ДНҚ бөлігін бөліп алдық, алайда ол 
əлі де болса геннің өзінен ұзындығы бойынша бірнеше есе үлкен. 
Фаг вектордың ішіне орта есеппен 15-20 мың н.ж. сыятындай 
құрастырылады, ал геннің орташа үзындығы – 1-2 мың н.ж. Міне, 
сондықтан жеке генді бөлу жұмысы осымен аяқталмайды. 

174
Гендер жинағынан бөлінген ДНҚ сегментін қайтадан əртүрлі 
рестриктазалармен үзеді, осының нəтижесінде ұзындығы бойын-
ша əртүрлі рестриктер немесе ДНҚ үзінділері алынады. Алынған 
үзінділерді электрофорезден өткізу нəтижесінде олар агарозалық 
гельде ұзындығына сəйкес таралады: үзінді қысқа болган сайын, ол 
электр өрісінің əсерімен агарозалық гельде жылдам қозғалады. Осын-
дай гельді бром этидиімен бояп, оның суреті бойынша рестриктердің 
ұзындығын анықтайды.

жүктеу/скачать 5,04 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: