Астана Медициналық Журналы

©Коллектив авторов, 2012
А.В. Ефремов, Е.В. Овсянко, Я.У. Овсянко, И.Д.Сафронов, М.Е.Тулеутаев
Рак  молочной  железы  (РМЖ)  является  наиболее  часто  встречающимся  онкологическим 
заболеванием  у  женщин:  им  болеют  8–9  %  лиц  женского  пола  в  развитых  странах  мира 
[1].  В Российской Федерации темп прироста заболеваемости за 10 лет составил 18,5 % [2]. 
Высокие показатели заболеваемости и смертности от РМЖ  обусловливают необходимость 
поиска новых видов терапии. Достижения последних лет в области молекулярной биологии 
позволили узнать некоторые особенности фенотипа опухоли, к которым относятся: индукция 
опухолью  сигналов  роста,  высокий  уровень  репликативного  потенциала,  резистентность  к 
рост  ингибиторным  сигналам,  уклонение  от  апоптоза. Известны  прогностические  факторы 
РМЖ,  один  из  которых,  наличие  на  поверхности  опухоли  рецепторов  стимулирующих 
апоптоз (р53, Bcl-2, Bax и др.) [3]. Известно, что одним из механизмов развития опухолевого 
роста является нарушение равновесия между процессами пролиферации клеток и апоптозом 
[4].  В  повреждение  регуляции  апоптоза,  приводящие  к  развитию  опухолевых  заболеваний, 
одно  из  центральных  мест  связано  с  экспрессией  одного  из  основных  звеньев  в  регуляции 
программированной гибели клетки – белков семейства Bcl-2. Эти белки играют важную роль 
в регуляции внутреннего (митохондриального) пути апоптоза.
Исследованию  участия  белков  семейства  Bcl-2  в  возникновение  и  развитие  опухолей, 
реализации противоопухолевого эффекта терапии в последние годы уделяется значительное 
внимание.  Большинство  работ  в  этой  области  выполнено  на  тканях  опухолей  людей,  что 
накладывает ограничения на исследования белков семейства Bcl-2 в динамике, а это необходимо 
для понимания роли апоптотических механизмов в реализации противоопухолевого эффекта 
и  возможного  использования  Bcl-2,  Bax  и  Bad  в  качестве  маркеров  при  мониторинге  и 
прогнозировании эффекта терапии. 
ЦЕЛЬ
Изучение с помощью иммуногистохимических методов экспрессию белков семейства Bcl-
2 в перевиваемой карциносаркоме Walker 256 при воздействии общей гипертермии на 7-е и 
14-е сутки после перевивки 
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
  В  эксперименте  использовали  крыс  самцов  линии  Wistar,  массой  180-200  г.  Работу  с 
животными  проводили  с  соблюдением  принципов  гуманности,  изложенных  в  директивах 
Европейского  сообщества  (86/609/ЕЕС)  и  Хельсинской  декларации.  Использовали  переви-
ваемый  штамм  опухоли  Walker  256  (W256),  поддерживаемый  in  vivo  (Лаборатория  физио-
логической  генетики  Института  цитологии  и  генетики  СО  РАН,  Новосибирск).  Суспензию 
клеток перевиваемой карциносаркомы Walker 256 вводили животным в мышцу бедра в дозе 
1 × 10
6
 клеток в 0,1 мл изотонического раствора NaCl [5]. Через 5 суток, с момента перевивки 
опухоли, когда ее объем достигал 2,51 ± 0,42 см3, животных разделяли на 2 группы: 1-я (n=7) 
– контроль со «спонтанным» развитием опухоли; 2-я (n=14) – при однократном воздействии 
общей гипертермией (ОГ) на 5-е сутки после трансплантации опухолевых клеток. Животных 
содержали  при  фиксированном  световом  режиме  (свет  –  темнота  12:12  с  включением 
освещения в 8.00 и выключением в 20.00).
Общая  гипертермия  животных  производилась  в  полном  соответствии  со  «Способом 
экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных» 
[6]. Температурный режим нагрева горячей воды-теплоносителя подбирался экспериментально 
и составил 45°С. Уровень общей гипертермии, при котором прекращали разогрев, определялся 
ректальной температурой 43,5°С (стадия теплового удара). Время разогревания каждой особи 
до уровня ректальной температуры 43,5°С было индивидуальным, не зависело от исходной 
температуры  тела,  массы  животного  и  составляло  не  более  17  минут.  F.  Meyer  et.  al.  [7] 
объясняют  столь  быстрое  повышение  температуры  тела  при  разогревании  в  условиях  90–
РЕФЕРАТИВТІ ХАБАРЛАМА
2012, №3(71) Астана медициналық журналы  
271

100% влажности полным прекращением процесса испарения пота и отсутствием, тем самым, 
эффективного охлаждения [8]. 
Опухолевою ткань для иммуногистохимического исследования брали в следующие сроки: 
1-ой группы – после 5-х суток, с момента перевивки опухоли; 2- ой – на 7-е и 14-е сутки, с 
момента проведения процедуры. 
Иммуногистохимическое  исследование  уровня  экспрессии  белков  семейства  Bcl-2 
выполняли на парафиновых срезах с помощью непрямого стрептавидин-авидинового метода 
[9]. Для выявления Bcl-2 и Bad в качестве первичных использовали мышиные моноклональные 
антитела  („BD  Biosciences“)  в  разведении  1:100.  Для  выявления  Bax  применяли  кроличьи 
поликлональные  антитела  к  домену,  играющему  важную  роль  в  образовании  гомодимеров 
и  гетеродимеров  с  антиапоптотическими  членами  семейства  Bcl-2  („BD  Biosciences“). 
Срезы  докрашивали  гематоксилином  и  эозином.  О  специфическом  связывание  антител 
свидетельствовало  выявляемое  дисперсное  мелкогранулярное  окрашивание  цитоплазмы 
клеток  (от  бледно-желтого  до  темно-коричневого  цвета).  Более  интенсивное  окрашивание 
соответствовало более высокому содержанию антигенов в клетках
Морфометрическое  исследование  изучали  на  фотографических  снимках  при  помощи 
моторизованного  микроскопа  M200  (Zeiss)  и  камерой  AxioCam  HRc  (Zeiss)  с  конечным 
увеличением ×630. Подсчет осуществляли с помощью компьютерной программы Axio Vision 
– Release 4.7.1. (Zeiss) и блоком автоматических измерений (Auto measure). При подготовке 
программы были использованы следующие фильтр-маски – Segmentation, Sigma. В программу 
вычислений  вводилось  значение  процента  площади  позитивно  окрашиваемых  опухолевых 
элементов  (тестовая  площадь  составляла  39437  мкм²).  Для  каждой  группы  оценивалось 
по  40  изображений.  Полученные  в  экспериментах  цифровые  данные  обрабатывали  с 
использованием  общепринятых  методов  статистики  [10],  уровень  значимости  различий 
средних величин оценивали по t-критерию Стьюдента. 
РЕЗУЛЬТАТЫ  И ОБСУЖДЕНИЕ
Полученные  результаты  представлены  в  таблице.  Ранее  в  нашей  работе  мы  указывали 
[11],  что  при  сравнительной  оценки  экспрессии  белков  семейства  Bcl-2  при  «спонтанном» 
развитии опухоли не было выявлено достоверных различий между величинами показателей 
Bcl-2  и  Bax.  Уровень  показателя  экспрессии  Bad  был  достоверно  выше,  соответствующих 
величин показателей Bcl-2 и Bax в 1,64 и 1,7 раза, соответственно. Возможно, апоптоз является 
фактором,  сдерживающий  рост  опухоли  на  ранних  стадиях  развития.  По  наблюдениям 
Bowen I.D., Bowen S.M. [12] в молодых опухолях на начальных стадиях развития происходит 
активация апоптоза, но с увеличением массы опухоли апоптоз резко падает и сохраняется на 
относительно стабильном уровне.
При микроскопическом исследовании на протяжении всего эксперимента при воздействии 
ОГ в центре опухоли наблюдали обширный ишемический некроз, свидетельствующий об ее 
интенсивном росте. Участки жизнеспособной ткани сохранялись на периферии, прилежащей 
к  капсуле.  Солидный  рост  карциносаркомы  Walker  256  сопровождался  преобладанием 
крупных,  округлых  светлых  опухолевых  клеток.  Имелись  значительно  более  редкие 
клетки,  по-одиночке  и  мелкими  скоплениями  с  темными  гиперхромными  ядрами,    с  более 
узкой  цитоплазмой  1:200.  Карциносаркома  Walker  256  содержала  значительное  количество 
тонкостенных сосудов капиллярного типа, чаще с ветвящимися профилями. В более крупных 
сосудах в просвете содержались эритроциты и пристеночно расположенные нейтрофилы, в 
более  мелких  либо  единичные  эритроциты,  либо  эритроциты  отсутствовали.  К  7-м  суткам 
отмечали в виде очагов увеличение гиперхромные клетки с формированием звездчатых или 
неправильной формы „незрелых“ капилляров. На 14 сутки, после воздействия ОГ, встречались 
немногочисленные  профили  зрелых  крупных  сосудов  и  нервов,  с  оформленной  стенкой. 
Карциносаркома  Walker  256    прорастала  в  поперечно-полосатую    скелетную  мышечную 
ткань.  В  участках  инвазии  карциносаркома  Walker  256  в  скелетную  мышечную  ткань 
отмечали несколько другой клеточный состав: клеточные элементы мельче, более выражена 
волокнистая строма, сосуды капиллярного типа. 
По  данным  количественного  анализа  интенсивности  иммуногистохимических  реакций 
при воздействии ОГ на протяжение всего эксперимента резко возрастал уровень экспрессии 
промоторов  апоптоза  Bax  и  Bad,  инициирующие  программируемую  клеточную  смерть 
в  присутствии  ингибиторов  каспаз.  Выявлено,  что  показатель  уровня  экспрессии  Bad,  как 
на  7-е,  так  и  на  14-е  сутки  эксперимента  был  выше  уровня  величины  того  же  показателя 
группы  контрольных  животных  со  «спонтанным»  развитием  опухоли  в  2,08  и  2,16  раза 
соответственно  (табл.).  Экспрессия  уровня  проапоптогенного  белка  Bax  была  также  выше 
РЕФЕРАТИВНЫЕ СООБЩЕНИЯ
272
2012, №3(71) Астана медициналық журналы  

соответствующего показателя уровня контроля, в большей степени на 7-е сутки, в 3,74 и 1,74 
раза, соответственно. Высвобождение этих белков происходит при повышении проницаемости 
мембран  митохондрий  под  контролем  белков  семейства  Bcl-2/Bax  (табл.).  Отношение  Bcl-
2  и  Bax  находятся  в  состоянии  постоянного  динамического  равновесия,  образуя  гомо-  и 
гетеродимеры,  что  завершается  апоптозом  клетки  [13].Ранее  нами  было  обнаружено,  что 
при  воздействии  ОГ  на  крыс  линии  Wistar  с  перевиваемой  карциносаркомой  Walker  256, 
повышенное на 14-е сутки содержание ТБК-активных продуктов, уровня диеновых конъюгатов, 
а также увеличение активности лизосомных ферментов (арилсульфатазы А- и N-ацетил-ß,D-
глюкозаминидазы)  в  сыворотке  крови,  свидетельствующие  о  стимуляции  окислительного 
стресса, индуцирующий гибель клеток Walker 256 путем апоптоза [14]. Важно отметить, что 
уровень экспрессии протоонкогена Bcl-2 при воздействии общей гипертермии, на протяжение 
всего эксперимента, достоверно ниже соответствующего показателя контроля у животных со 
«спонтанным» развитием опухоли, в большей  степени на 14-е сутки эксперимента в 1,52 и 
2,23 раза, соответственно.
Таким образом, полученные данные, могут свидетельствовать о том, что члены семейства 
белков Bcl-2 непрерывно взаимодействуют друг с другом, находясь в динамическом равновесии 
между  гомо-  и  гетеродимерами.  Показано,  что  решающим  моментом  в  запуске  апоптоза 
карциносаркомы Walker 256, вероятно, является гетеродимеризация белков семейства Bcl-2. 
Выявлена выраженная индукция апоптоза при воздействии общей гипертермии.
ЛИТЕРАТУРА
1. 
Silva O. E., Zurrida S. Breast Cancer / A Practical Guide Third Edition, 2005. 21 p.
2. 
Порханов  В.А,  Барышев  А.Г,  Тесленко  Л.Г.  и  др.  Анализ  и  пути  совершенствования 
онкологической службы Краснодарского края (1999–2008 годы). Краснодар, 2009. С. 252.
3. 
Маru D. HER-2/neu аnd р53 over expression as biomarkers of breast carcinoma in women age 30 
years andyounger // Cancer. 2005. Vol. 103, № 5. P. 900–905.
4. 
Белушкина Н.Н. Особенности регуляции апоптоза опухолевых клеток // Вестник Российской 
академии  медицинских  наук  :  ежемесячный  научно-теоретический  журнал  /  Российская  академия 
медицинских наук. 2008. № 10. С. 15-20.
5.  Хегай  И.И.,  Попова  Н.А.,  Ганилова  Л.С.  и  др.  Динамика  опухоле-вого  роста  у  крыс  линии 
Brattleboro и Wag при введении разных доз карцино-саркомы Walker 256 // Бюллетень эксперименталь-
ной биологии и медицины. 2008. Т. 145, № 1. С. 88–90.
6.  Ефремов  А.В.,  Пахомова  Ю.В.,  Пахомов  Е.А.  и  др.  Патент  2165105  Российская  Федерация. 
Способ экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных / 
опубл. 2001б. Бюл. № 10.
7. Meyer F., Bar-Or O., McDougal D. Sweat electrolyte loss during exercise in the heat effects of gen-
derand naturacion // Med. Sci Sports Exers. 1992. Vol. 24. P. 776–781.
8. 329.Monte O., Zyngier S., Kimura E.T. et al. Dopaminergic and somatostatinergic pathways decrease 
serum  thyrotropin  in  rats  bearing  the  256-Walker  mammary  carcinoma  // Arq.  Bras.  Endocrinol.  Metabol. 
2005. Vol. 49, № 2. P. 253–264.
9. Эллиниди В.Н. Практическая иммуногистохимия: метод. рек. / В. Н. Эллиниди, Н. В. Аникиева, 
Н. А. Максимова. Спб., 2002. 36 с.
10. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М., 1999.
11.  Овсянко  Е.В.,  Ефремов  А.В.,  Лушникова  Е.Л.,  Ларионов  П.М.,  Архипов  С.А.,  Непомнящих 
Л.М., Овсянко Я.У. Иммуногистохимичкский анализ программируемой гибели клеток карциносарко-
мы Walker 256 при воздействии цитостатическими препаратами // Бюлл. эксп. биологии и медицины. 
2009. Т. 149, № 10. С. 455 – 460.
12. Bowen I.D., Bowen S.M. Programmed cell death in tumours and tissues. London. Champman and hall, 
1990.
13. A.M. Molecular  ordering of the cell death  pathway – Bcl-2  and Bcl-X(L) function upstream of the 
CED-3-like apoptotic proteases // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 4573 – 4576.
14. Пупышев А.Б., Федина Р.Г., Мичурина С.В., Овсянко Е.В., Ефремов А.В.Эффект общей управ-
ляемой гипертермии на содержание продуктов липидпероксидации и активность лизосомных фермен-
тов в сывортки крови у крыс с карциносаркомой Walker -256 // Вопросы онкологии. 2009. Т. 55, № 2. 
С. 221 – 223.
РЕФЕРАТИВТІ ХАБАРЛАМА
2012, №3(71) Астана медициналық журналы  
273

©Коллектив авторов, 2012
А.В.Ефремов, Е.В. Овсянко, И.Д. Сафронов,  М.Е. Тулеутаев, Д.Л. Колодин 
ГБОУ ВПО « Новосибирский государственный медицинский университет»
С
овременный  этап  изучения  патогенеза  опухолевых  заболеваний  характеризуется 
определением  роли  различных  регуляторных  механизмов  и  систем  в  развитии  и 
течении  пролиферативных  процессов  в  организме.  Эти  регуляторные  механизмы  весьма 
разнообразны - нейрогенные гормональные, рецепторные и др., но имеют сложный характер 
функционирования и взаимосвязи. Они, как и целый ряд регуляторных систем – иммунной, 
гемостатической и др. – определяют гомеостаз организма и его защиту от онкогенных факторов 
внешней  и  внутренней  среды.  Необходимо  отметить,  что  большую  роль  в  регуляторных 
механизмах  играет  окислительный  стресс,  который  являясь  неспецифическим  процессом, 
принимает  активное  участие  в  адаптационно-компенсаторных  реакциях,  патогенезе  и 
саногенезе  широкого  ряда  заболеваний.  Известно,  что  радикальные  формы  кислорода  и 
азота, с одной стороны, используются для регуляции энергетических систем клетки, с другой 
-  могут  индуцировать  деструкцию  мембран,  снижать  активность  ферментов  и  гормонов, 
вызвать повреждения ДНК, нарушение клеточного цикла и, в конечном итоге, инициировать 
опухолевый  рост  [3].  В  связи  с  чем,  исследование  механизмов  регуляции  канцерогенеза,  а 
также  поиск  подходов  коррекции  его  активности  является  важной  задачей  современной 
онкологии.
Одним  из  таких  подходов  может  являться  гипертермическая  онкология,  активно 
развивающееся в последние годы направление в лечении злокачественных новообразований, 
связанное  с  использованием  высокой  температуры  для  повышения  эффективности 
комплексной  терапии.  Известно,  что  в  результате  воздействия  искусственной  общей 
гипертермии (ОГ) создается возможность запуска саногенетических механизмов организма, 
при которых происходит не только разрушение опухолевой ткани, но и стимуляция апоптоза, 
активация системных и локальных механизмов иммунного ответа [1].
Поэтому представляется целесообразным провести исследование особенностей изменения 
состояния  окислительного  стресса  на  этапах  опухолевого  роста  при  воздействии  общей 
гипертермии.
ЦЕЛЬ
Изучение изменения параметров системы «про-/антиоксиданты» при действии на организм 
животных общей гипертермии в условиях экспериментального канцерогенеза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В эксперименте использовали 55 крыс-самцов Вистар массой 180-200 г. Работу с живот-
ными проводили  согласно директивам Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинк-
ской декларации. Использовали перевиваемый штамм опухоли Walker 256, поддерживаемый 
in vivo в лаборатории физиологической генетики Института цитологии и генетики СО РАН (г. 
Новосибирск). Суспензию клеток карциносаркомы Walker 256 вводили животным в мышцу 
бедра (10
6
клеток в 0,1 мл изотонического раствора NaCl).
Используемый способ моделирования искусственной ОГ у мелких лабораторных животных 
[7]  предполагает  разогревание  объекта  исследования  в  резервуаре  универсального  водного 
термостата BWT-U, предназначенного для точного поддержания установленной температуры 
в  диапазоне  от  25°С  до  100°С.  Уровень  ОГ,  при  котором  прекращали  разогрев  животных, 
определялся ректальной температурой 43,5°С (стадия теплового удара). Время разогревания 
каждого животного было индивидуальным, не зависело от исходной температуры тела, массы 
и составляло не более 17 мин.
Прооксидантную  активность  (ПОА)  сыворотки  крови  определяли  с  помощью 
лейкоцитарных  тестов  [6],  общую  антиоксидантную  активность  (АОА)  сыворотки  крови 
определяли  методом  хемилюминесценции  (ХЛ)  по  степени  торможения  суммарной  ХЛ 
светимости, запускаемой 3% Н
2
О
2
 [4]. Для оценки баланса в системе «про-/антиоксиданты» 
РЕФЕРАТИВНЫЕ СООБЩЕНИЯ
274
2012, №3(71) Астана медициналық журналы  

были произведены расчеты коэффициента соотношения (КС) между ПОА/АОА.
Определение  ПОА,  АОА  и  КС  осуществляли  в  3  группах:  1-я  группа  –  перевиваемая 
карциносаркома Walker-256 после ОГ (n= 24); 2-я группа – интактные крысы после ОГ (n= 
24); 3-я группа – контроль (интактные крысы без воздействия ОГ, n= 7). Использовали следу-
ющие сроки исследования: 3, 7 и 14 сутки после проведения ОГ.
Полученные количественные данные обрабатывали с использованием методов статистики 
[2],  уровень  значимости  различий  средних  величин  оценивали  на  основании  t-критерия 
Стьюдента для уровня достоверности 95% (p < 0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Согласно  современным  представлениям,  свободные  радикалы  играют  важную  роль  как 
в  инициации  канцерогенеза  (вызывая  модификацию  ДНК),  так  и  промоции  опухолевого 
роста,  когда  инициированная  клетка  постепенно  приобретает  фенотипические  черты 
злокачественной клетки [3].
При  оценке  влияния  ОГ  на  ПОА  сыворотки  крови  крыс  с  карциносаркомой  Walker  256 
было установлено (табл. 1), что этот показатель возрастал к 3-м суткам эксперимента в 2,8 
раза, по сравнению с контролем (p < 0,05). При этом ПОА сыворотки крови также была досто-
верно выше, чем у интактных животных, подвергавшихся ОГ (p < 0,05). Подобное, но менее 
выраженное повышение ПОА сыворотки крови сохранялось через 7 и 14 суток после ОГ у 
крыс с карциносаркомой Walker 256.
Таблица 1.Прооксидантная активность сыворотки крови (усл. ед.) после воздействия 
общей гипертермии на крыс с карциносаркомой Walker-256 (М±m)
Группа
Сроки исследования (сутки)
3-и
7-е
14-е
Перевиваемая карциносаркома Walker-256 после 
ОГ
0,79±0,01*/**
0,52±0,007*/**
0,36±0,005*
Интактные крысы после ОГ
0,26±0,003
0,36±0,005*
0,29±0,004
Контроль (интактные крысы)
0,28±0,003
Примечание: * – значения, достоверно отличающиеся от контрольных крыс;
** – значения, достоверно отличающиеся от группы интактных крыс после ОГ.
При анализе АОА после воздействия ОГ было обнаружено (табл. 2), что величина этого 
показателя на 3-и сутки у интактных крыс достоверно возросла в 1,3 раза (p < 0,05), по срав-
нению с контролем. Высокие уровни АОА в данной экспериментальной группе сохранялись 
и на 7 – 14-е сутки эксперимента (p < 0,05). Аналогичная закономерность прослеживалась и 
в группе крыс с карциносаркомой Walker 256, подвергнувшихся воздействию ОГ. Через 3, 7 
и 14 сутки АОА сыворотки крови крыс опухоленосителей была выше, чем в контроле соот-
ветственно в 1,5, 1,7 и 1,4 раза (p < 0,05).

жүктеу/скачать 7,88 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: