Рецензируемый медицинский научно-практический журнал

Наука и Здравоохранение, 2, 2016 
Оригинальные исследования
 
107
 
Summary 
 
MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS OF GRANULOSA 
CELLS OF MICE OVARIAN UNDER LINDANE EXPOSURE 
 
Aru D. Balmagambetova ¹, 
http://org/0000-0003-1151-5651  
Gulmira A. Zhurabekova ¹, 
http://orcid.org/0000-0002-2166-3095  
Guido Macchiarelli ², 
http://orcid.org/0000-0003-1040-5338 
 
Maria Grazia Palmerini ², 
http://orcid.org/0000-0003-3171-5888 
 
Stefania Anarita Nottola ³, 
http://orcid.org/0000-0003-1829-5989
 
 
¹  West  Kazakhstan  State  Medical  University  n.a.  M.  Ospanov,  Department  of  Normal  and 
Topographical anatomy, Department of Life, Health and Environmental Sciences and Center of 
Electron Microscopies, Aktobe, Kazakhstan; 
²  University  of  L’Aquila,  Department  of  Anatomy,  Histology,  Forensic  Medicine  and 
Orthopaedics, Laboratory of Electron Microscopy n.a. Pietro M. Motta, L’Aquila, Italy; 
³ University La Sapienza, Rome, Italy 
 
Introduction. Analysis of materials that characterize the human environment in the Aral Sea, has 
shown a sharp increase of the chemical (pesticides, fertilizers, salt components, heavy metals) pollution 
of drinking water, air, soil, pesticide contamination of food products of plant and animal origin, fishery 
products.  
Aim. Еvaluate the ultrastructural changes in granulosa cells of mice under the exposure of lindane 
pesticide in vitro. 
Methods. The experimental work carried out in the
 
Laboratory
 
Centre of Microscopy Department of 
Life, Health and Environmental Sciences  University L’Aquila, Italy; 80 female mice control (10),  control 
with solution of dimethyl sulfoxide (10), lindane 1 μM (20), lindane 10 μM (20), lindane 100 μM (20). The 
material of the study were ovarian granulosa cells. After preparing the samples for transmission electron 
microscopy,  ultra-thin  sections  (60-80  nm)  were  obtained  on  an  ultramicrotome  and  contrasted  with 
salts of heavy metals with uranyl acetate and lead citrate (Sic Rome, Italy). 
Results. Comparative analysis of the  group showed the dependence of ultrastructural changes in 
the applied lindane concentration.The presence of irregularly shaped cells were observed early signs of 
fragmentation of the cytoplasm, which was filled with a plurality of mitochondria and fatty droplets. In the 
group with the highest concentration of toxicant cells appeared marginalization of chromatin remnants of 
apoptotic bodies and single organelles. 
Conclusion. The exposure of lindane in vitro have shown a dose-dependent toxicity effect on the 
granulosa cells; ultrastructural changes caused granulosa cells strictly correlated on the applied dose. 
Keywords: Aral sea, environment, lindane, granulosa cells. 
 
Түйін 
 
ЛИНДАННЫҢ ӘСЕРІМЕН ТЫШҚАНДАРДЫҢ АНАЛЫҚ 
БЕЗДЕРІНІҢ ТҮЙІРШІКТІ ЖАСУШАЛАРЫНЫҢ 
МОРФОЛОГИЯЛЫҚ СИПАТТАМАСЫ 
 
Ару Д. Балмагамбетова ¹, 
http://org/0000-0003-1151-5651  
Гульмира А. Журабекова ¹, 
http://orcid.org/0000-0002-2166-3095 
 
Гуидо Маккиарелли ², 
http://orcid.org/0000-0003-1040-5338 
 
Мария Грация Пальмерини ², 
http://orcid.org/0000-0003-3171-5888  
Стефания Анарита Ноттола ³, 
http://orcid.org/0000-0003-1829-5989 
 

Original article 
Science & Healthcare, 2, 2016 
108 
¹ Марат Оспанов атындағы Батыс Қазақстан Мемлекеттік медицина университеті
, 
Қалыпты
 
және  топографиялық  анатомия  кафедрасы,  Микроскопия  орталығы 
Өмір,  денсаулық  сақтау  және  қоршаған  ортаны  қорғау  ғылымдар  кафедрасы, 
Актөбе
 
қ.
, 
Қазақстан;
 
²Л´Акуила университеті,  Анатомия, гистология, сот медицинасы және ортопедия 
кафедрасы, «Пьетро М. Мотта» атындағы электрондық микроскопия зертханасы, 
Л´Акуила
 
қ.
, 
Италия;
 
³ Ла
-
Сапиенза университеті Рим
 
қ
.
, Италия
 
 
Кіріспе.  Арал  маңындағы  адамдардың  тұратын  ортасын  сипаттайтын  материалдардың 
талдамасы  ауыз  суының,  атмосфера  ауасының,  топырақтың  химиялық  ластануының 
(пестицидтер,  минералдық  тыңайтқыштар,  тұз  компоненттері,  ауыр  металлдар),  өсімдік  және 
жануар текті азық-түліктің, балық өнімдерінің пестицидтік ластануының күрт өскенін көрсетті.  
Зерттеу  мақсаты.  In  vitro  эксперимент  жағдайларында  линдан  пестицидінің  әсерімен 
тышқандардың  түйіршікті  жасушаларының  ультрақұрылымдық  өзгеруін  бағалау  болып 
табылды. 
Әдістері.  Эксперименттік  жұмыс  Л`акуила,  Италия  университетінің  Микроскопия  орталығы 
Өмір,  денсаулық  сақтау  және  қоршаған  ортаны  қорғау  ғылымдар  кафедрасының 
зертханасында  жүзеге  асырылады;  80  аналық  тышқандарға  бақылау  (10),  бақылау 
диметилсульфоксид ерітіндісімен (10), линдан 1 µM (20), линдан 10 µM (20), линдан 100 µM (20) 
жүргізілді.  Зерттеу  материалы  аналық  бездің  түйіршікті  жасушалары.  Трансмиссиялық 
электрондық  микроскопия  сынамаларды  дайындау  кейін,  ультра  жұқа  кесінділер  (60-80  нм) 
ультрамикротоммен алынды және уранилцитрат және қорғасын цитрат (Sic Рим, Италия) ауыр 
металдарының тұздарымен өнделген. 
Нәтижесі.  Топтарды  салыстырмалы  талдау  барысында  ультрақұрылымдық  өзгерістер 
линданның қолданбалы концентрациясынан тәуелділігін көрсетті. Бұрыс пішінді жасушалардың, 
цитоплазма фрагментациясының бастапқы белгілері және цитоплазманың май тамшыларымен 
көптеген  митохондрийлердің  толуы  байқалды.  Уландырғыш  заттың  жоғары  концентрациясы 
қолданылған  топтарда  жасушалардың  хроматин  маргинализациясы,  апоптозды  денелердің 
және жеке органеллалар қалдықтарының пайда болуымен сипатталды. 
Қорытынды. In vitro линданының әсері түйіршікті жасушаларға тәуелді уландырғыш әсерді  
көрсетті;  түйіршікті  жасушалардың  ультрақұрылымдық  өзгерістері  қолданылған  мөлшерге 
сәйкес туғызылғаны мәлім болды. 
Негізгі сөздер: Арал теңізі, қоршаған орта, линдан, түйіршікті жасушалар 
 
 
Библиографическая ссылка: 
Балмагамбетова  А.  Д.,  Журабекова  Г.А.,  Маккиарелли  Г.,  Пальмерини  М.Г.,  Ноттола  С.А. 
Морфологическая характеристика гранулезных клеток яичников мышей при воздействии линдана / / Наука 
и Здравоохранение. 2016. №2. С. 106-117. 
Balmagambetova  A.D.,  Zhurabekova  G.A.,  Macchiarelli  G.,  Palmerini  M.G.,  Nottola  S.A.  Morphological 
characteristics of granulosa cells of mice ovarian under lindane exposure. Nauka i Zdravookhranenie [Science & 
Healthcare]. 2016, 2, pp. 106-117. 
Балмағамбетова А.Д., Жорабекова Г.А., Маккиарелли Г., Пальмерини М.Г., Ноттола С.А. Линданның 
әсерімен тышқандардың аналық бездерінің түйіршікті жасушаларының морфологиялық сипаттамасы / / 
Ғылым және Денсаулық сақтау. 2016. №2. Б. 106-117. 
 
 
Введение 
Загрязняющие  вещества,  имея  широкий 
диапазон  влияния  на  здоровье  человека, 
могут  иметь  различные  неблагоприятные 
последствия, 
запуская 
целый 
ряд 
патологических  реакции  организма  [28,5].  В 
настоящее время развитие промышленности 
приводит  к  загрязнению  окружающей  среды 
различными 
отходами, 
химикатами, 
тяжелыми  металлами.  Для  Казахстана 
экологической  проблемой  стала  трагедия 
Аральского  моря,  которая  привела  к 

Наука и Здравоохранение, 2, 2016 
Оригинальные исследования
 
109
 
экстремально-экологической, 
социально-
экономической 
и 
санитарно-
эпидемиологической  ситуаций,  с  резким 
ухудшением  состояния  здоровья  населения 
[1,2].  Данные  литературы  по  изучению 
проблемы  Арала  показали,  что  в  пылевых 
частицах  со  дна  моря  преобладают 
хлорорганические пестициды: 
1.
 
Дихлорфенилдихлорэтилен
;
 
2.
 
Гептахлор; 
3.
 
Гексахлорциклогексан; 
4.
 
Гексахлоран; 
5.
 
Альдрин; 
Одним из агрессивных представителей из 
этого  ряда  хлорорганических  пестицидов 
является  гамма-гексахлорциклогексан  или 
линдан [4,18,17]. 
Линдан  (гамма-гексахлорциклогексан),  и 
его  изомеры  являются  хлорорганическими 
соединениями 
пестицидов, 
которые 
представляют  собой  коричневато-белый 
кристаллический  порошок  с  резким  запахом. 
Линдан  известен  в  качестве  инсектицида  в 
обработке 
древесины 
и 
деревянных 
конструкций,  семян  зерновых,  плодовых  и 
овощных культур, в приманках для борьбы с 
грызунами,  а  также  для  лечения  чесотки 
(клещи)  и  вшей  [3,26,25].  Линдан  крайне 
опасен  для  человека  и  вреден  для 
окружающей  среды.  Отравление  линданом, 
как и другими поллютантами содержащимися 
в окружающей среде, происходит в основном 
пероральным путем, кожу, и путем вдыхания 
паров. Он быстро всасывается из желудочно-
кишечного  тракта,  и  начинает  всесторонне 
распространятся 
по 
организму. 
Особенностями  их  негативного  воздействия 
на  организм  является  то,  что  эти  вещества 
могут 
аккумулироваться 
в 
организме 
длительное  время  и  оказывать  постепенный 
эффект  или  отражаться  на  здоровье 
потомства.  На  сегодняшний  день  известно 
большое  количество  экспериментальных  и 
клинических исследований воздействия этого 
веществ 
на 
организм 
человека 
и 
экспериментальных животных [7,14,22,32,23]. 
По данным ряда авторов наиболее уязвимой 
к  воздействию  хлорсодержащих  пестицидов 
является женская репродуктивная система. 
Целью  данного  исследования  явилась 
оценка 
ультраструктурных 
изменений 
гранулезных  клеток  мышей  под  действием 
линдана  в  условиях  in  vitro  эксперимента. 
Задачи  для  достижения  цели  определить 
прогностические  критерии  функциональной 
активности  яичников  в  эксперименте  на 
основе 
ультрамикроскопического 
исследования 
гранулезных 
клеток 
фолликулов, 
оценка 
ультрамикроскопического 
исследования 
методом 
трансмиссионной 
электронной 
микроскопии. 
Материал  и  методы  исследования 
Данная 
экспериментальная 
работа 
проведена 
в 
лаборатории 
Центра 
микроскопии  Департамента  жизни,  здоровья 
и  наук  об  окружающей  среде  университета 
Л`Акуила,  Италия;  в  период  с  мая  по  июль 
2014 года на 80 мышах-самках, возраст 21-23 
дня,  весом  25-30гр.  Животных  содержали  в 
соответствии  с  руководством  по  уходу  и 
использованию лабораторных животных, все 
протоколы  исследования  были  одобрены 
местным  Комитетом  по  уходу  за  животными 
от  08.10.2013г.  №4  (университета  Л´Акуила, 
Италия). 
Животные 
перед 
экспериментом 
содержались в условиях карантина, затем во 
время 
эксперимента 
содержались 
со 
свободным  доступом  к  воде  и  пище,  в 
условиях  постоянной  температуры  (21-22  ° 
C),  с  соблюдением  светового  режима  12/12 
[10]. 
Выбор  данного  вида  лабораторных 
животных 
основан 
на 
проведении 
экспериментальных 
исследований 
репродуктивной  системы  и  обусловлен 
схожестью  физиологии  и  генетики  с 
человеческим  организмом,  в  ускоренности 
процесса  размножения,  доступностью  в 
приобретении [11]. 
Вначале  эксперимента  для  стимуляции 
фолликулогенеза  самкам  вводили  5  ЕД 
сыворотки  PMSG  (Pregnant  Mare  Serum 
Gonadotropin)  –  сыворотка  гонадотропина 
фолликулостимулирующего  действия.  Через 
48  часов  под  легким  эфирным  наркозом 
проводили 
забой 
животных 
методом 
цервикальной дислокации [24]. 
Изъятия  яичников  проводилось  путем 
вскрытия 
передней 
брюшной 
стенки, 
отыскивались  маточные  трубы  на  концах 

Original article 
Science & Healthcare, 2, 2016 
110 
которых  в  слое  жировой  клетчатки 
обнаруживались яичники, которые осторожно 
срезались.  Изъятый  орган  под  микроскопом 
тщательно  очищали  от  жировой  клетчатки. 
Органы  промывались  в  растворе  PBS  - 
Phosphate buffered saline (фосфатный буфер 
–  физиологический  раствор  с  рН:  7-7.4)  при 
37  °  С,  затем  переносились  в  чашки  для  
культивирования  (1008,  Becton  Dickinson  и 
Компания, Franklin Lakes, Нью-Джерси, США), 
содержащей  сбор  MEM  hepes  -  Minimum 
Essential  Medium  Eagle  Modification  (Life 
Technologies  Italia,  Fil.  Life  Technologies 
Europe  BV,  Monza  MB,  Италия),  высокой 
мощности 
буферизации. 
Путем 
прокалывания 
яичников 
извлекалось 
содержимое  фолликулов  преовуляторных 
или гранулезных клеток, и получали кучевые 
ооцит-клеточные  комплексы  [12].  Смесь 
перемещалась  в  капсулы  3001  (Becton 
Dickinson  Company,  и  Franklin  Lakes,  NJ, 
США). 
Концентрация  линдана  для  in  vitro 
исследований взаимствована Ханнелоре др., 
1998,  [9]  в  диапазоне  от  7,5  до  100  µM  и 
использована  в  диапазоне  от  1  до  100  µM. 
Таким образом, определены 5 групп: 
1) контроль (10) 
2)  Контроль  с  раствором  (диметил-
сульфоксид, ДМСО) (10) 
3) Линдан 1 µM (20) 
4) Линдан 10 µM (20) 
5) Линдан 100 µM (20) 
Этапы: 
Для 
созревания 
клеток 
была 
использована  среда  DMEM  -  Dulbecco's 
Modified  Eagle  Medium  (GE  Healthcare,  Little 
Chalfont,  Buckinghamshire,  Великобритания) 
5%  FBS,  дополненная  2  mM  L-глутамина  и 
антибиотиками (пенициллин 100 mM и 100  g 
/  ml  стрептомицин)  (Sigma  Life  Science, 
Spruce  Street,  St.  Louis,  MO,  США).  В 
контроле  с  раствором  ДМСО  использован  в 
концентрации 0,01%. Линдан (  - 1,2,3,4,5,6 - 
гексахлорциклогексан)  (Sigma  Life  Science, 
Spruce  Street,  St.  Louis,  MO,  USA  45548-
250MG)  разводили  в  диметилсульфоксиде 
(Sigma  Life  Science,  Spruce  Street,  St.  Louis, 
MO,  США),  чтобы  получить  концентрации 
описанные 
выше. 
Серии 
разведения 
готовились от исходного раствора ДМСО, для 
получения конечной концентрации 1, 10 и 100 
μM,  но  таким  образом,  чтобы  не  превышать 
максимальную концентрацию ДМСО 0,1%. 
Образцы помещались в термостат при 37 
°  С  и  5%  СО2  в  течение  24  часов.  После 
промывания  в  PBS,  центрифугирования  и 
фиксирования  в  2.5%  глутаральдегиде  (SIC, 
Roma,Италия) в PBS.  
Подготовка 
образцов 
для 
трансмиссионной  электронной  микроскопии 
(ТЭМ). 
ТЭМ: промывка в PBS, постфиксация с 1% 
тетраоксида  осмия  (Agar  Scientific,  Stansted, 
Великобритания)  в  PBS  и  с  повторной 
промывкой  в  PBS.  Гранулы  помещены  в  1% 
агар,  который  подвергся  дегидратации  в 
возрастающей  серии  спиртов  (Carlo  Erba 
реагенты, Milan, Италия). 
Далее 
образцы 
фиксированы 
в  
пропиленоксиде  в  течение  двадцати  минут 
(BDH  Italia,  Milan,  Италия),  с  последующим 
добавлением  эпоксидной  смолы  (Electron 
Microscopy  Sciences,  1560  Industry  Road, 
Hatfield, 
PA, 
UK 
Великобритания). 
Ультратонкие 
срезы 
получены 
на 
ультрамикротоме Reichert-Jung Ultracut. 
Ультратонкие  срезы  (60-80  нм)  получены 
на  ультрамикротоме  и  контрастированы 
солями  тяжелых  металлов:  уранилацетатом 
и  цитратом  свинца  (Sic  Рим,  Италия). 
Получены микрофотографии с Zeiss EM 10 и 
трансмиссионной  электронной  микроскопией 
Philips CM 100 (80 кВ). 
Результаты исследования 
Группа  1  (контроль).  Трансмиссионная 
электронная  микроскопия  дает  хорошую 
возможность 
оценить 
внутриклеточную 
организацию.  Так  хорошо  визуализируется 
цитоплазма, 
включающая 
ядро, 
митохондрии, 
трубчатые 
элементы 
эндоплазматического  ретикулума,  комплекс 
Гольджи и липиды. 
В  ядре  прослеживаются  бороздчатые 
глубокие  перегибы,  ограниченные  ядерной 
мембраной,  заметен  хроматин,  равномерно 
распределенный  в  сгустках  или  утолщен. 
Митохондрии  многочисленны,  круглой  или 
эллиптической 
формы, 
заметны 
их 
митохондриальные кристы и разделяющие их 
электронно-плотные  двойные  мембраны. 
Выявлены 
многочисленные 
трубчатые 

Наука и Здравоохранение, 2, 2016 
Оригинальные исследования
 
111
 
электронегативные 
элементы 
гладкой 
эндоплазматической 
сети. 
Обнаружены 
нерегулярные  контуры  пузырьков  Гольджи  и 
капли жиров. 
Мембрана 
плазмы 
и 
цитоплазмы 
представлена 
многочисленными 
микроворсинками, 
что 
указывает 
на 
интенсивную 
активность 
межклеточной 
коммуникации. 
В 
цитоплазме 
также 
содержатся  электронегативные  небольшие 
пузырьки  и  остатки  клеток.  Гранулезные 
клетки были идентифицированы в культуре в 
разной  степени  дегенерации,  о  чем 
свидетельствовали  апоптозные  тела  и 
клеточные фрагменты. Даже среди очевидно 
здоровой 
популяции 
клеток, 
часто 
отмечались 
ультраструктурные 
морфологические признаки, указывающие на 
апоптоз - такие, как маргинализация ядра (на 
ранних  стадиях  апоптоза),  везикулизацией 
плазматической  мембраны  ("блеббинга"), 
неорганизованных  органелл,  неповрежден-
ной клеточной мембраной (рис 1). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Рисунок  1.  На  снимке  ТЭМ  ультраструктура 
гранулезных клеток контрольной группы, GC: 
гранулезные  клетки;  N:  ядро;  Nu:  ядрышко; 
GL: липидные капли,  MV: микроворсинки. 
 
Группа 
2. 
Под 
действием 
диметилсульфоксида  (ДМСО),  раствора, 
использованного  для  разведения  линдана, 
популяция 
гранулезных 
клеток 
была 
представлена,  здоровыми  клетками  -  более 
или менее с четким округлым ядром и одним 
или 
несколько 
сильно 
окрашенными 
ядрышками  –  вперемешку  с  апоптозными 
клетками  и  многочисленными  клеточными 
фрагментами.  В  отличие  от  контроля, 
некоторые 
клетки 
показали 
более 
интенсивный цвет, чем другие зоны. 
На  ТЭМ  клетки,  имеют  неправильную 
форму,  зачастую  с  инвагинацией  ядерной 
мембраны.  Некоторые  клетки  содержали 
большое  количество  жировых  капель  в 
частности  митохондриях.  В  нескольких 
отмечалось частичное втягивание клеточных 
соединений, 
которые 
не 
постоянно 
проявлялись. 
Было  обнаружено  явление  клеточной 
дегенерации  как  раз  характерной  для  этой 
группы, с инвагинацией ядерной и клеточной 
фрагментации, с наличием апоптозных тел и 
везикулизацией ядерной мембраны (рис 2). 
 
 
 
Рисунок 
2. 
ТЭМ 
ультраструктура 
гранулезных клеток контроль ДМСО. Клетки с 
признаками 
втягивания 
межклеточных 
контактов  (стрелки).  N:  ядро;  GL:  жировые 
капли. 
 
Группа  3.  Оценка  ТЭМ  выявила  наличие 
клеток  неправильной  формы,  оснащенных 
большими  яйцевидной  формы  ядрышками, 
содержащих  хроматин,  сгруппированных  в 
центре или склонных к приближению ядерной 
мембране.  
На некоторых участках были обнаружены 
начальные 
признаки 
фрагментации 
1 
 
GC 
gl 
mv 
N 
 
Nu 

Original article 
Science & Healthcare, 2, 2016 
112 
цитоплазмы.  Цитоплазма  была  заполнена 
множеством  митохондрии  и  жировыми 
каплями (рис 3). 
 
 
 
Рисунок 3. ТЭМ ультраструктура гранулезных 
клеток  линдан  1  µM.  Неправильной  формы 
клетки,  с  признаками  фрагментации  клетки 
(звездочки).  MV:  микроворсинки;  N:  ядро;  м: 
митохондрии; GL: жировые капли. 
 
Группа 4. В данной группе культивирован-
ные 
клетки 
при 
дозе 
10 
µM 
характеризовались  изменением  в  ядре, 
слегка  неправильной  формы  и  наличием 
бледных  апоптозных  тел  разной  величины. 
Ультраструктурный анализ показал структуру 
явной  дегенерации  клеток,  как  показано 
клетки  с  маргинализацией  хроматина, 
апоптозными телами и остатками единичных 
органелл 
или 
фрагментами 
цитоплазматической мембраны (рис 4). 
 
 
 
Рисунок 4. ТЭМ ультраструктура гранулезных 
клеток  при  дозе  10µM  линдан.  Дегенерация 
клеток с утолщением хроматина под ядерной 
мембраной,  с  фрагментами  цитоплазмы  по 
близости  и  апоптозное  тело  (са),  N:  ядро;  fc: 
фрагменты клетки, mn: ядерная мембрана 

жүктеу/скачать 7,91 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: