Репликация днк: учебное пособие

И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие»
34
необходимы праймер в качестве акцептора дезоксинуклеотида и матрица, определяющая
присоединение нужного нуклеотида. Помимо полимеризации нуклеотидов, Ро11 катализи-
рует две другие реакции, биологическая роль которых очень важна. В одной из них проис-
ходит гидролиз фосфодиэфирных связей в одной цепи ДНК или на неспаренном конце дуп-
лексной ДНК, причем за один акт удаляется один нуклеотид, начиная с 3'-конца цепи (3'-5'-
экзонуклеаза). Вторая реакция также состоит в отщеплении нуклеотидов, но гидролиз начи-
нается с 5'-конца двунитевой ДНК в направлении к 3'-концу (5'-3'-экзонуклеаза). Эти различ-
ные активности присущи разным сайтам полипептидиой цепи РоlI, Если in vitro обработать
РоlI трипсином, то полипептидная цепь расщепится на большой и малый фрагменты. Боль-
шой, С-концевой фрагмент («фрагмент Кленова») сохраняет ДНК-полимеразную и 3' -5'-
экзонуклеазную активности; малый N-концевой фрагмент обладает только 5'-3'-экзонукле-
азной активностью.
РоlI и присущие ей экзонуклеазные активности играют очень большую роль в репли-
кации и репарации хромосомной ДНК Е. соli. 3’-5'-экзонуклеазная активность обеспечивает
контроль за присоединением каждого нуклеотида и удаление ошибочных нуклеотидов вновь
синтезированной цепи. Если эта активность подавлена в результате каких-то мутаций в гене,
кодирующем РоlI, то при репликации генома часто происходят мутации – замены оснований.
Способность ДНК-полимеразы удлинять 3'-конец нити, спаренной с матричной нитью,
позволяет ей заполнять пробелы между сегментами отстающей нити. РоlI удлиняет фраг-
менты Оказаки с 3'-концов и удаляет рибонуклеотиды праймера, с которых начинаются 5'-
концы соседних фрагментов, что является необходимой предпосылкой для формирования
непрерывной отстающей цепи. Поскольку РоlI способна удлинять 3'-конец одной из цепей в
месте разрыва в двунитевой ДНК и удалять нуклеотиды с 5'-конца того же разрыва (процесс,
называемый ник-трансляцией), этот фермент играет ключевую роль в репарации поврежден-
ной ДНК. Ник-трансляция широко используется in vitro для синтеза радиоактивно меченой
ДНК.
У Е. соli имеются и две другие ДНК-полимеразы, но они присутствуют в клетке в мень-
ших количествах. РоlII присоединяет нуклеотиды значительно менее эффективно, чем Ро11,
и не обладает 5'-З'-экзонуклеазной активностью. Следовательно, РоlII может заполнять про-
белы между фрагментами ДНК, спаренными с матричной цепью, но не способна отщеплять
РНК-нуклеотиды от фрагментов Оказаки или осуществлять ник-трансляцию. Роль РоlII в
репликации и сохранении хромосомной ДНК Е. соli до настоящего момента неясна. Веро-
ятно, она может участвовать в восстановлении синтеза ДНК после повреждения и остановки
вилки репликации. Такой процесс принято называть ресинтезом.
PolIII-холофермент – это ключевой фермент, ответственный за репликацию хромосом-
ной ДНК Е. соli. В каждой клетке содержится только 10–20 копий PolIII – холофермента, но
именно он является основным компонентом мультиферментного полимеразного комплекса,
инициирующего формирование репликативных вилок в точках начала репликации, участву-
ющего в элонгации лидирующей цепи в вилке и удлиняющего РНК-праймеры с образова-
нием фрагментов Оказаки. Так как PolIII – холофермент не обладает 5'-3'-экзонуклеазной
активностью, для репликации отстающей цепи необходимо участие РоlI, чтобы произошло
удлинение продукта, образовавшегося при участии PolIII, и удаление РНК-праймеров на 5'-
конце фрагментов Оказаки.
Методом направленного мутационного анализа обнаружены изменения в полипептид-
ной цепи основного (кор) фермента PolIII, и изучены аминокислотные замены, которые поз-
воляют приписать определенные виды ферментативной активности конкретным субъеди-
ницам ферментного комплекса. Так, α-субъединица обладает полимеразной активностью, а
ε-субъединица – 3' 5'-экзонуклеазной. Однако комплекс α– и ε-субъединиц обладает значи-

И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие»
35
тельно более высокой полимеразной и экзонуклеазной активностями, чем каждая из соот-
ветствующих субъединиц в отдельности. Функция третьей, θ-субъединицы пока неясна.
Помимо субъединиц, составляющих PolIII – кор, PolIII-холофермент содержит еще
семь субъединиц: τ,γ,β,δ,δ’,χ, и ψ. Перечисленные полипепгиды также существуют во мно-
жестве копий, так что в результате мол. масса полимеразного комплекса составляет при-
мерно 10
3
кДа. Роль β-субъединицы заключается в том, чтобы свести к минимуму веро-
ятность отделения фермента от матрицы до завершения процесса копирования, то есть
работает как «зажим». Субъединица τ является фактором димеризации репликативных
холоферментов. Точная же функция других субъединиц неизвестна. Вполне возможно, что
PolIII-холофермент существует в двух формах, каждая из которых содержит определенный
набор вспомогательных субъединиц, придающих ферменту определенные свойства. В одной
форме фермент катализирует синтез непрерывной ведущей цепи, а в другой – прерывистой
отстающей.
PolIII-холофермент катализирует же реакции синтеза, что и PolI, но работает примерно
в 60 раз быстрее. Более того, PolIII-холофермент обладает повышенным сродством к мат-
рице и обеспечивает более высокую эффективность копирования. PolIII-холофермент может
связываться и с другими белками, увеличивая эффективность процесса копирования благо-
даря координации некоторых важных ферментативных этапов репликации. На этом более
высоком уровне организации в комплексы могут включаться белки, расплетающие спираль
ДНК в точках начала репликации и в репликативных вилках (геликазы), инициирующие
образование праймерных РНК (праймазы), обеспечивающие последовательное наращива-
ние цепей ДНК, терминирующие процесс репликации и разделяющие дочерние спирали
ДНК.
ДНК-полимеразы, синтезируемые другими бактериями и многими бактериофагами,
различаются по своим физической структуре и свойствам. Тем не менее, катализируемые
ими реакции практически идентичны реакциям, изученным у Е. соli. У всех ДНК-полимераз
есть корректирующая 3'-5'-экзонуклеаза, однако 5'-3'-экзонуклеаза у большинства фермен-
тов отсутствует. Например, ДНК-полимераза фага Т4 может осуществлять 3'-5'-экзонукле-
азную реакцию и корректировать ошибки репликации, но не способна катализировать 5'– З'-
экзонуклеазную реакцию и поэтому не может обеспечить ник-трансляцию. При репликации
ДНК фага Т4 5'-3'-экзонуклеазную реакцию удаления РНК-праймеров перед объединением
фрагментов Оказаки катализирует другой кодируемый фагом белок. В процессе прерыви-
стого синтеза отстающих нитей и репарации повреждений ДНК фага Т4 этот фермент рабо-
тает согласованно с фаговой ДНК-полимеразой. Некоторые вирусы животных (например,
герпесвирус, вирус коровьей оспы и вирус гепатита) индуцируют синтез особых полимераз
для репликации своих геномов.
Другие вирусы образуют белки, которые стимулируют системы репликации клеточной
ДНК или участвуют в репликации вирусной ДНК. Например, паповавирусы синтезируют
белки, необходимые для инициации репликации. Аденовирусы человека кодируют белки,
«запускающие» инициацию синтеза обеих цепей линейной вирусной ДНК. Они продуци-
руют также особые ДНК-связывающие белки, облегчающие репликацию.

жүктеу/скачать 2,57 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: