С курсом факультета повышения квалификации и переподготовки кадров

Глава  19.  ТЕХНОЛОГИЯ  ПОЛУЧЕНИЯ  И  СТАНДАРТИЗАЦИЯ 
ФЕРМЕНТОВ  
 
243 
 
оптическую  плотность  при  длине  волны,  характерной  для  используемого 
субстрата или конечного продукта, образующегося в данной реакции. 
Необходимо  иметь  произвольно  выбранную  единицу  фермента,  с 
помощью  которой  можно  было  бы  количественно  выразить  чистоту  и 
активность  различных  фракций.  В  большинстве  случаев  выбор  единицы 
зависит 
от 
избираемого 
метода 
определения. 
В 
случае 
спектрофотометрического  метода  такой  единицей  может  служить 
количество  фермента,  которое  вызывает  определенное  изменение  в 
оптической плотности за определенное время при данных условиях опыта; 
если  определяется  продукт  реакции,  то  единицей  будет  количество 
фермента,  которое  вызывает  образование  определенного  количества 
вещества в 1 минуту, и т.п. Тогда удельную активность фермента, которая 
является мерой чистоты ферментного средства, выражают числом единиц в 
1 мг вещества (белка). 
К разновидностям таким методов относят метод Горнелла (измеряют 
поглощение продукта биуретовой реакции в диапазоне длин волн: от 550 до 
650  нм),  биуретовые  микрометоды,  метод  Фолина-Чокальтеу  (основан  на 
взаимодействии 
фермента 
с 
фосфорномолибденово-вольфрамовым 
реактивом в слабощелочной среде с образованием продуктов, окрашенных 
в синий цвет). 
Для  целей  определения  ферментов  могут  быть  использованы  не 
только измерение поглощения света, но также измерения флуоресценции – 
спектрофлуориметрические  методы.  Такое  определение  активности 
фермента 
в 
ряде 
случаев 
по 
чувствительности 
превосходит 
спектрофотометрические  методы  на  целый  порядок.  Некоторые 
коферменты и субстраты обладают сильной флуоресценцией. НАД и НАДФ 
в  восстановленном  состоянии  имеют  сильную  флуоресценцию  и  не 
флуоресцируют в окисленном состоянии. 
Манометрические  методы.  Эти  методы  используют  при 
определении  активности  фермента  в  тех  случаях,  когда  в  исследуемых 
реакциях  один  из  компонентов  находится  в  газообразном  состоянии.  К 
таким  реакциям  относятся,  главным  образом,  те,  которые  связаны  с 
процессами  окисления  и  декарбоксилирования,  сопровождающимися 
поглощением  или  выделением  кислорода,  или  углекислого  газа,  а  также 
реакции, в которых выделение или связывание газа происходит в результате 
взаимодействия продуктов ферментативного превращения с добавленным в 
систему реактивом. Наблюдение за ходом реакции во времени проводится в 
специальных приборах – манометрических аппаратах Варбурга. 

жүктеу/скачать 2,61 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: