С курсом факультета повышения квалификации и переподготовки кадров
жүктеу/скачать 2,61 Mb. Pdf көрінісі
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Манометрические методы
| Способы оценки активности
Спектрофотометрические методы. Эти методы отличаются высокой чувствительностью, быстротой определения, малым расходованием фермента, реактивов и позволяют следить за протеканием реакции во времени. Для этого реакционную смесь помещают в термостатируемую кювету. Через малый промежуток времени после добавления фермента (или субстрата) и быстрого перемешивания измеряют Глава 19. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ 243 оптическую плотность при длине волны, характерной для используемого субстрата или конечного продукта, образующегося в данной реакции. Необходимо иметь произвольно выбранную единицу фермента, с помощью которой можно было бы количественно выразить чистоту и активность различных фракций. В большинстве случаев выбор единицы зависит от избираемого метода определения. В случае спектрофотометрического метода такой единицей может служить количество фермента, которое вызывает определенное изменение в оптической плотности за определенное время при данных условиях опыта; если определяется продукт реакции, то единицей будет количество фермента, которое вызывает образование определенного количества вещества в 1 минуту, и т.п. Тогда удельную активность фермента, которая является мерой чистоты ферментного средства, выражают числом единиц в 1 мг вещества (белка). К разновидностям таким методов относят метод Горнелла (измеряют поглощение продукта биуретовой реакции в диапазоне длин волн: от 550 до 650 нм), биуретовые микрометоды, метод Фолина-Чокальтеу (основан на взаимодействии фермента с фосфорномолибденово-вольфрамовым реактивом в слабощелочной среде с образованием продуктов, окрашенных в синий цвет). Для целей определения ферментов могут быть использованы не только измерение поглощения света, но также измерения флуоресценции – спектрофлуориметрические методы. Такое определение активности фермента в ряде случаев по чувствительности превосходит спектрофотометрические методы на целый порядок. Некоторые коферменты и субстраты обладают сильной флуоресценцией. НАД и НАДФ в восстановленном состоянии имеют сильную флуоресценцию и не флуоресцируют в окисленном состоянии. Манометрические методы. Эти методы используют при определении активности фермента в тех случаях, когда в исследуемых реакциях один из компонентов находится в газообразном состоянии. К таким реакциям относятся, главным образом, те, которые связаны с процессами окисления и декарбоксилирования, сопровождающимися поглощением или выделением кислорода, или углекислого газа, а также реакции, в которых выделение или связывание газа происходит в результате взаимодействия продуктов ферментативного превращения с добавленным в систему реактивом. Наблюдение за ходом реакции во времени проводится в специальных приборах – манометрических аппаратах Варбурга. |